O loʻo lauiloa i totonu ole aʻoaʻoga tutotonu, o le RNA o le transcriptional mediator i le va o le DNA ma le faʻamatalaga o le porotini.Pe a faʻatusatusa i le suʻesuʻeina o le DNA, o le suʻesuʻeina o le RNA e mafai ona sili atu ona faʻaalia le faʻaalia o le gene i totonu o meaola.Faʻataʻitaʻiga e aofia ai le RNA e aofia ai: qRT-PCR, RNA-Seq, ma fusion gene detection, ma isi. Faʻavae i luga o uiga o le RNA lava ia (o le mama suka o le RNA o loʻo i ai le tasi vaega sili atu le hydroxyl free nai lo le suka suka o DNA), faʻatasi ma le tele o RNases i le siosiomaga, RNA e sili atu le le mautonu ma faigofie ona faʻaleagaina nai lo DNA.O lapisi i totonu, lapisi i fafo, afai e le lelei le tulaga o le RNA, e tatau ona le faamalieina i'uga fa'ata'ita'i, fa'aalia fa'apitoa o fa'amatalaga le sa'o po'o le toe fa'afo'isia.O le mea lea, e tatau ona sili atu le gauai i le faagasologa o le RNA, ma o le sootaga o le pulea lelei e sili atu ona taua e mautinoa ai le saʻo ma le saʻo o faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga mulimuli ane.

Mo le pulea lelei o le RNA, e masani lava o loʻo faʻaaogaina auala masani:

• Spectrophotometry
• gel electrophoresis agarose
• Agilent Bioanalyzer
• PCR fa'ata'ita'i fa'afoma'i taimi moni
• Qubit felanulanua'i auala

01 Spectrophotometry

O le RNA o loʻo tuʻufaʻatasia faʻatasi faʻalua ma o loʻo i ai le maualuga o le absorption ile galu ole 260nm.E tusa ai ma le tulafono a Lambert-Beer, e mafai ona tatou fuafuaina le faʻaogaina o le RNA mai le maualuga o le absorption ile 260nm.E le gata i lea, e mafai foi ona tatou fuafuaina le mama o le RNA e tusa ai ma le fua faatatau o le 260nm, 280nm ma le 230nm absorption peaks.280nm ma le 230nm o le maualuga o le absorption o polotini ma molelaiti laiti, i le faasologa.Ole fua ole A260 / A280 ma le A260 / A230 o le mama RNA agavaa e tatau ona sili atu nai lo le 2. Afai e itiiti ifo i le 2, o lona uiga o loʻo i ai le palatini poʻo le laʻititi laʻititi o le RNA faʻataʻitaʻiga ma e manaʻomia ona toe faʻamamaina.O puna fa'aleaga o le a a'afia ai fa'ata'ita'iga i lalo, e pei o le taofia o le fa'atuputeleina lelei o tali PCR, ma i'u ai i fa'ai'uga le sa'o.O le mama o le RNA e iai sona aafiaga tele i fa'ai'uga mulimuli ane, o lea la o le spectrophotometry e masani lava o se feso'ota'iga e mana'omia le pulea lelei i le laasaga muamua i su'ega nucleic acid.

Ata 1. Alaleo Fa'asa'o RNA/DNA masani

02 Agarose gel electrophoresis

I le faaopoopo atu i le mama, o le faamaoni o le RNA o se tasi lea o faailo taua mo le faamasinoina o le lelei o le RNA.O le faʻaleagaina o le RNA o le a taʻitaʻia ai le tele o vaega pupuu i totonu o le faʻataʻitaʻiga, o lea o le a faʻaitiitia ai le numera o vaega RNA e mafai ona iloa lelei ma ufiufi e le faʻasologa faʻasologa.RNA fa'amaoni e mafai ona siakiina e le electrophoresis o le RNA atoa ile 1% agarose gel.O lenei metotia e mafai ona fa'atulagaina e oe lava le gel, pe fa'aaoga le E-Gel™ System mo le su'ega fa'amaoni.E sili atu nai lo le 80% o le RNA atoa o le RNA ribosomal, o le tele o ia mea e aofia ai le 28S ma le 18S rRNA (i le mammalian system).O le RNA lelei lelei o le a faʻaalia ai ni paʻu malamalama se lua, o le 28S ma le 18S paʻu susulu, i le 5 Kb ma le 2 Kb, ma o le fua faatatau o le a latalata i le 2: 1.Afai o loʻo i totonu o se tulaga faʻasalalau, o lona uiga o le RNA faʻataʻitaʻiga atonu na faʻaleagaina, ma e fautuaina e faʻaoga le auala o loʻo faʻamatalaina mulimuli ane e suʻe atili ai le lelei o le RNA.

Ata 2. Fa'atusatusaga o le fa'aleagaina (lane 2) ma le RNA 'uma (lane 3) i luga o le electrophoresis gel agarose.

03 Agilent Bioanalyzer

I le faaopoopo atu i le agarose gel electrophoresis metotia o loʻo faʻamatalaina i luga, lea e mafai ona fesoasoani ia i matou e iloa ai le faʻamaoni o le RNA faigofie ma vave, e mafai foi ona matou faʻaogaina le Agilent bioanalyzer e fuafua ai le faʻamaoni o le RNA.E faʻaaogaina se tuʻufaʻatasiga o microfluidics, capillary electrophoresis, ma fluorescence e iloilo ai le faʻatonuga o le RNA ma le faʻamaoni.I le faʻaaogaina o le algorithm faʻapipiʻiina e iloilo ai le talaaga o le faʻataʻitaʻiga RNA, e mafai e le Agilent bioanalyzer ona faʻatatau se faʻamatalaga RNA faʻamaoni tau, RNA Integrity Numera (e taʻua mulimuli ane o le RIN) [1].O le tele o le tau o le RIN, o le maualuga o le faʻamaoni o le RNA (1 e matua faʻaleagaina, 10 e sili ona atoatoa).O nisi fa'ata'ita'iga e aofia ai le RNA o lo'o fautuaina le fa'aogaina o le RIN e fai ma fa'ata'ita'iga mo su'esu'ega lelei.O le faia o suʻesuʻega faʻasolosolo maualuga (o loʻo taʻua mulimuli ane o le NGS) o se faʻataʻitaʻiga, o taʻiala a le Oncomine ™ Human Immune Repertoire, lea e faʻaaogaina e iloa ai le B cell ma le T cell antigen receptors i le Thermo Fisher's Oncomine panel series, fautua mai o faʻataʻitaʻiga ma RIN tau sili atu nai lo le 4, E sili atu le lelei faitau ma clones e mafai ona fuaina 3 (Ata).E eseese tulaga fautuaina mo paneli eseese, ma e masani lava o se RIN maualuga e mafai ona aumaia faʻamatalaga sili atu ona aoga.

Ata 3, i fa'ata'ita'iga Oncomine™ Human Immune Repertoire, fa'ata'ita'iga fa'atasi ma le RIN e sili atu nai lo le 4 e mafai ona iloa ai faitau sili atu ona lelei ma T cell clones.【2】

Ae ui i lea, o le tau RIN e iai foʻi ni tapulaʻa.E ui o le RIN o loʻo i ai se faʻasalalauga maualuga ma le lelei o faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga NGS, e le talafeagai mo faʻataʻitaʻiga FFPE.O fa'ata'ita'iga FFPE ua leva ona togafitia fa'ama'i, ma o le RNA na maua mai e masani lava ona maualalo le tau o le RIN.Ae ui i lea, e le o lona uiga o faʻamatalaga aoga o le suʻega e tatau ona le faʻamalieina.Ina ia faʻamaonia saʻo le lelei o faʻataʻitaʻiga FFPE, matou te manaʻomia le faʻaogaina o fua e ese mai i le RIN.I le faaopoopo atu i le RIN, e mafai foi e le Agilent bioanalyzer ona fuafua le tau o le DV200 e fai ma faʻataʻitaʻiga o le RNA quality.O le DV200 o se parakalafa e faʻatatauina le vaega o vaega e sili atu nai lo le 200 bp i se faʻataʻitaʻiga RNA.O le DV200 o se fa'ailoga sili atu o le FFPE fa'ata'ita'iga lelei nai lo le RIN.Mo le RNA na maua mai e le FFPE, e maualuga tele le fesoʻotaʻiga ma le numera o kenera e mafai ona iloa lelei ma le eseesega o kenera [3].E ui lava e mafai e le DV200 ona faʻaleleia le faʻaletonu i le suʻesuʻeina lelei o le FFPE, e le mafai lava e le Agilent bioanalyzer ona suʻesuʻeina atoatoa faʻafitauli lelei i faʻataʻitaʻiga RNA, e aofia ai pe iai ni inhibitors i totonu o faʻataʻitaʻiga.Inhibitors lava ia e mafai ona a'afia ai le fa'ateleina o fa'ata'ita'iga i lalo ma fa'aitiitia le aofa'i o fa'amatalaga aoga.Ina ia iloa pe i ai se inhibitor i totonu o le faʻataʻitaʻiga, e mafai ona tatou faʻaaogaina le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga PCR faʻataʻitaʻi-taimi o loʻo faʻamatalaina i lalo.

04 PCR fa'ata'ita'i fa'afoma'i taimi moni

O le taimi moni fluorescent quantitative PCR auala e le gata e mafai ona iloa le inhibitors i le faataitaiga, ae faʻaalia saʻo le lelei o le RNA i le faʻataʻitaʻiga FFPE.Pe a faatusatusa i le Agilent biological analyzers, e sili atu ona lauiloa meafaifaaili o le fluorescence quantitative i totonu o fale su'esu'e olaola tetele ona o lo latou faaaogaina lautele.Ina ia su'eina le tulaga lelei o fa'ata'ita'iga RNA, e na'o le fa'atau pe saunia o su'esu'ega muamua mo kenera fa'asino i totonu, pei ole GUSB (Cat nu. Hs00939627).I le faʻaaogaina o lenei seti o primers, suʻesuʻega ma faʻataʻitaʻiga (RNA atoa o le faʻaogaina o le faʻaogaina) e faʻatautaia ai suʻesuʻega faʻatusatusa atoatoa, e mafai ona faʻatusatusaina le faʻaogaina o le RNA fragment e pei o le faʻataʻitaʻiga o le RNA quality (Functional RNA Quantitation (FRQ) mo le pupuu).I se suʻega NGS, na matou iloa ai o le FRQ o faʻataʻitaʻiga RNA e maualuga tele le fesoʻotaʻiga ma le tele o faʻamaumauga aoga.Mo faʻataʻitaʻiga uma e sili atu nai lo le 0.2ng/uL FRQ, a itiiti ifo i le 70% o faitauga e mafai ona faʻaogaina lelei le faʻasologa o faʻamatalaga (Ata 4).

Ata 4, o le tau o le FRQ na maua e le fluorescence quantitative method o loʻo i ai se faʻasalalauga maualuga tele (R2> 0.9) faʻatasi ai ma faʻamatalaga aoga na maua i le suʻega NGS.Ole laina mumu ole tau ole FRQ e tutusa ile 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

I le faaopoopo atu i le faʻaogaina i faʻataʻitaʻiga FFPE, o le taimi moni quantitative PCR metotia e mafai foi ona mataʻituina lelei inhibitors i faʻataʻitaʻiga.E mafai ona matou faʻaopoopoina le faʻataʻitaʻiga ina ia iloa i totonu o le tali faʻaogaina ma le Pulea Lelei i totonu (IPC) ma lona Suʻega, ona faʻatino lea o le faʻatusatusaina o le fluorescence e maua ai le tau Ct.Afai o le tau o le Ct e tua i tua o le tau o le Ct i le leai o se faʻataʻitaʻiga, o loʻo faʻaalia ai o loʻo i ai le inhibitor i le faʻataʻitaʻiga ma faʻalavelaveina le faʻamalosia lelei i le tali.

05 Qubit auala vali felanulanua'i

Qubit Fluorometer o le masini laʻititi e masani ona faʻaaogaina mo le faʻaogaina o le nucleic acid ma le suʻesuʻeina o le mama, lea e faigofie ona faʻaogaina ma o loʻo i ai i le toetoe lava o suʻesuʻega biology molecular uma.E sa'o le fa'atatauina o le fa'aogaina o le nucleic acid e ala i le su'eina ma le nucleic acid-binding fluorescent dye (Qubit detection reagent).Qubit e maualuga lona lagona ma faʻapitoa, ma e mafai ona faʻamaonia saʻo le RNA i lalo i le pg / μL faʻatonuga.I le faaopoopo atu i le tomai lauiloa e faʻatatau tonu le faʻaogaina o le nucleic acid, o le ata fou fou a Thermo Fisher, Qubit 4.0, e mafai foi ona iloa le saʻo o le RNA.O le Qubit 4.0's RNA detection system (RNA IQ Assay) e iloa ai le fa'amaoni o le RNA e ala i le su'esu'eina i le taimi e tasi ni vali fa'ama'i e lua.O nei lanu felanulanua'i e lua e mafai ona fusifusia i ni vaega tetele ma ni vaega laiti o le RNA.O nei lanu felanulanua'i e lua o lo'o fa'aalia ai le tele o vaega tetele o le RNA i totonu o le fa'ata'ita'iga, ma mai lea mea e mafai ona fa'atatauina le tau o le IQ (Fa'amaoni ma le Tulaga) e fai ma sui o le RNA.Ole tau ole IQ e fa'atatau ile FFPE ma fa'ata'ita'iga e le o le FFPE, ma e iai sona aafiaga tele ile fa'asologa mulimuli ane.O le faia o suʻesuʻega NGS e fai ma faʻataʻitaʻiga, i le RNA-Seq suʻega suʻega na faia i luga o le Ion torrent ™ platform, o le tele o faʻataʻitaʻiga e iai le IQ e sili atu nai lo le 4 e le itiiti ifo i le 50% le faitau lelei (Ata 5).Pe a faʻatusatusa i metotia o loʻo taʻua i luga, Qubit IQ Assay e le gata e sili atu ona faigofie e faʻagaioia ma faʻaitiitia ai le taimi (i totonu o le lima minute), ae o loʻo i ai foi se faʻamaopoopoina tele i le va o le fuaina o le IQ tau ma le tulaga lelei o faʻamatalaga o faʻataʻitaʻiga i lalo.

Ata 5, o loʻo i ai se fesoʻotaʻiga tele i le va o le Qubit RNA IQ tau ma le faʻafanua faitau o le RNA-Seq.【5】

E ala i le folasaga o loʻo i luga, ou te talitonu o loʻo i ai i tagata uma le malamalama lelei i auala eseese e pulea ai le lelei o le RNA.I le faʻatinoga, e mafai ona e filifilile auala fetaui e tusa ai ma le ituaiga faʻataʻitaʻiga ma mea faigaluega o loʻo iai.Na'o le pulea lelei o le RNA lelei e mafai ai ona tatou aloese mai le toilalo o fa'ata'ita'iga mulimuli ane ona o le le lelei o fa'ata'ita'iga lelei, ma fa'asaoina ai taimi taua, malosi ma tau.

Fa'amatalaga oloa:

Manu Aofa'i RNA Isolation Kit

Cell Total RNA Isolation Kit

faasinomaga

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.O le RIN: o se numera faʻamaoni RNA mo le tuʻuina atu o faʻamaumauga faʻamaoni i fuataga RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Oncomine Human Immune Repertoire Taiala mo Tagata Fa'aaoga (Pub. Nu. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Fa'aleleia Tulaga Tulaga Fa'atatau mo le Su'esu'eina o le RNA Fa'atupuina Mai Fa'amaumauga Fa'apalapala Fa'apipi'i Paraffini Fa'ata'ita'iga, Toxicological Sciences, Volume 170, Aukuso 3, Tusi 3, Tusi 3, Tusi 170, Aokuso3.https://doi.org/10.1093/toxsci/