Ua matou maua poto masani gaosi.Manumalo le to'atele i tusipasi taua o lana maketi mo le Pa'u Tele Saina High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, O le tulaga lelei o le fale gaosi oloa, Taulai atu i manaoga o tagata faatau o le puna lea o le ola ma le atinaʻeina o kamupani, Matou te pipii atu i le faʻamaoni ma le faʻamaoni galue uiga, tulimatai atu i lou sau!
Ua matou maua poto masani gaosi.Manumalo le tele o tusipasi taua o lana maketi moSaina Taq DNA Polymerase, Qpcr, O loʻo folafola mai e le matou kamupani: tau talafeagai, taimi puʻupuʻu gaosiga ma faʻamalieina pe a uma le faʻatau atu, matou te faʻafeiloaia foi oe e asiasi i la matou fale gaosimea i soo se taimi e te manaʻo ai.Mana'o i le taimi nei e maua se matou pisinisi fiafia ma umi fa'atasi!!!

Fa'amatalaga

O lenei pusa o loʻo faʻaaogaina se faiga faʻapipiʻi lysis faʻapitoa e mafai ona vave faʻasaʻo le RNA mai faʻataʻitaʻiga faʻaleaganuʻu mo le RT-qPCR tali, ma faʻaumatia ai le taimi faʻaalu ma le galue RNA faʻamamaina.E mafai ona maua le mamanu RNA ile na'o le 7 minute.O le 5×Direct RT Mix ma le 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagents e saunia e le pusa e mafai ona vave ma lelei ona maua i'uga o le PCR fa'atusatusa i le taimi moni.

5 × Direct RT Mix ma 2 × Direct qPCR Mix-SYBR o loʻo i ai le faʻapalepale malosi o le inhibitor, ma o le lysate o faʻataʻitaʻiga e mafai ona faʻaaogaina e fai ma faʻataʻitaʻiga mo RT-qPCR saʻo.O lenei pusa o loʻo i ai le RNA maualuga-affinity Foregene reverse transcriptase, ma Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂, tali fa'afefete, PCR optimizer ma fa'amautu.

Fa'amatalaga

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Vaega o pusa

Fa'apitoa & itu lelei

■ Faigofie ma aoga : faʻatasi ai ma le Cell Direct RT tekinolosi, RNA faʻataʻitaʻiga e mafai ona maua i totonu o le 7 minute.

■ O le faʻataʻitaʻiga manaʻoga e laʻititi, e pei o le 10 sela e mafai ona suʻeina.

■ Tulaga maualuga: e mafai ona vave iloa le RNA i sela o loʻo faʻatupuina ile 384, 96, 24, 12, 6-well plates.

■ DNA Eraser e mafai ona vave aveese genomes tatala, faʻaitiitia le aʻafiaga i faʻataʻitaʻiga mulimuli ane.

■ Optimized RT ma qPCR system e sili atu ona lelei le fa'aliliuina o le RT-PCR la'asaga e lua ma sili atu ona patino le PCR, ma sili atu ona fa'asa'o ile fa'ainitaneti tali ole RT-qPCR.

Fa'aoga pusa

Avanoa o le faʻaogaina: sela faʻaleaganuʻu.

- RNA fa'amatuu mai ile fa'ata'ita'iga lysis: na'o le fa'ata'ita'iga RT-qPCR o lenei pusa.

- O le pusa e mafai ona faʻaoga mo faʻamoemoega nei: suʻesuʻega faʻamatalaga o kenera, faʻamaoniga o le siRNA-mediated gene silencing effect, suʻesuʻeina o fualaau, ma isi.

Ata

Teuina ma le ola fa'asao

Vaega I o lenei pusa e tatau ona teuina i le 4 ℃;Vaega II e tatau ona teuina ile -20℃.

Foregene Protease Plus II e tatau ona teuina i le 4℃, aua le fa'aisa ile -20℃.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR e tatau ona teuina i le -20 ℃ i le pogisa;pe a faʻaaoga soo, e mafai foi ona teuina i le 4 ℃ mo le teuina mo taimi pupuu (faʻaaogaina i totonu ole 10 aso).O le manumalo i le tele o tusipasi taua o lana maketi mo le Big discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Quality is factory' life , Taulai atu i manaoga o tagata faatau o le puna lea o le ola ma le atinaʻeina o kamupani, Matou te pipii atu i le faamaoni ma le faʻatuatua lelei uiga galue, tulimatai atu i lou afio mai!
Pa'u teleSaina Taq DNA Polymerase, Qpcr, O loʻo folafola mai e le matou kamupani: tau talafeagai, taimi puʻupuʻu gaosiga ma le faʻamalieina pe a uma le faʻatau atu, matou te faʻafeiloaia foi oe e asiasi i la matou fale gaosimea i soo se taimi e te manaʻo ai.Mana'o i le taimi nei e maua se matou pisinisi fiafia ma umi fa'atasi!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

Mo cell direct RT-qPCR fa'aoga ≤ 1000,000 sela

Folasaga o oloa

O lenei oloa faʻaaogaina se faiga faʻapipiʻi lysis tulaga ese e vave faʻasaʻo ai le RNA mai faʻataʻitaʻiga cell aganuʻu mo tali RT-qPCR, faʻaumatia le faʻaogaina o le taimi ma le galue RNA faʻamamaina, ma naʻo 7 minute e maua ai le faʻataʻitaʻiga RNA manaʻomia, faʻatasi ai ma le 5x Direct RT Mix, 2x Direct qPCR Mix-Taqman saunia e le pusa e mafai ona maua vave ma lelei atoatoa taunuuga PCR taimi.

5 × Direct RT Mix ma le 2 × Direct qPCR Mix-Taqman e malosi le fa'apalepale fa'apolopolo ma e mafai ona fa'atino lelei le fesuia'i ma fa'alautele fa'apitoa e fa'aaoga ai le lysate o le fa'ata'ita'iga e fuaina o se fa'ata'ita'iga.O lo'o iai le reagent ole Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl.₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer ma Stabilizer, lea e mafai ona faʻaaogaina ma le lysis buffer e vave ma faigofie ona iloa faʻataʻitaʻiga, ma o loʻo i ai uiga o le maualuga o le lagona, faʻapitoa ma le mautu.

Fa'ailoga oloa

Fa'atekonolosi faigofie ma aoga Cell Direct RT e na'o le 7 minute e maua ai fa'ata'ita'iga RNA.

Fa'ata'ita'iga mana'oga e la'ititi, ma le itiiti ifo i le 10 sela fa'aleaganu'u e mafai ona fa'aoga mo fa'ata'ita'iga.

Ole maualuga ole gaosiga mo le mauaina vave ole RNA o sela faʻaleaganuʻu pei ole 384, 96, 24, 12, ma le 6-well plates.

E mafai e DNA Eraser ona vave aveese genomes ua tatalaina, e matua faʻaitiitia ai le aʻafiaga i faʻataʻitaʻiga mulimuli.

Optimized RT ma qPCR faiga e mafai ai le lua-laasaga RT-PCR ma sili atu le lelei o le faʻaliliuina faʻaliliuga, faʻapitoa, ma le malosi o le faʻapalepale tali a le RT-qPCR.

Fa'aoga pusa

Avanoa o le faʻaoga: Sel faʻatupuina.

Fa'ata'ita'iga lysis fa'amatalaina le RNA: fa'aaogaina na'o se la'asaga lua RT-qPCR template.

E mafai ona fa'aogaina pusa mo fa'amoemoega nei: su'esu'ega o fa'amatalaga fa'atonuga o le kenera, su'ega allele, su'esu'ega o vaila'au, ma isi.

tapula'a pusa

Vaega fa'asili ≤ 300 bp.

E fa'aoga pusa e fa'aola ai sela fou.

Puleaina lelei o oloa

E tusa ai ma le FOREGENE's Total Quality Management System, o vaega taʻitasi o le Cell Direct RT-qPCR faʻasologa o pusa e faʻataʻitaʻiina ma le malosi i le tele o taimi e faʻamautinoa ai le faʻamaoni ma le mautu o le lelei o pusa taʻitasi o pusa.

mea i totonu o pusa

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman e mafai ona fa'atau ese'ese, fa'amatalaga o lo'o tu'uina atu ile Fa'aopoopo 1 (IUULAU 13).

Tulaga teuina

1. Tulaga Va'a

O le faagasologa atoa o felauaiga pusa pusa aisa maualalo vevela, ia mautinoa o le pusa o loʻo i le <4 °C setete.

2. Tulaga teuina

Teu le vaega I ile 4°C ma le Vaega II ile -20°C.

Ole Foregene Protease Plus II e tatau ona teu ile 4°C, ae le o le aisa ile -20°C.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman o lo'o teuina ile -20°C, po'o le 4°C mo le fa'aoga pu'upu'u pe a fa'aaoga soo (i totonu ole 10 aso).

Fa'amatalaga vaega o pusa

Buffer CL: Tuuina atu le si'osi'omaga e mana'omia mo tali lysis cell.

Buffer ST: Fa'amutaina le vaila'au malosi i le lysate e aloese ai mai a'afiaga ile RT mulimuli ane.

DNA Eraser: DNA aveese, o le aafiaga o le aveesea o le genome i suʻesuʻega mulimuli ane.

5× Direct RT Mix: E iai le maualuga o le RNA affinity Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilizers, enhancers, optimizers, ma fa'aliliuga transcription primers mo le fa'aogaina lelei (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: I le tulaga o le lysis buffer, o sela e lysed e faʻasaʻo ai le nucleic acids.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: O lenei reagent e iai le Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, tali fa'afefete, PCR optimizer, ma fa'amautu.

20× ROX Reference Dye: E masani ona faʻaaogaina i luga ole taimi moni PCR faʻalauteleina meafaifaʻaili a ABI, Stratagene ma isi kamupani, e faʻaaogaina e fetuunai ai le eseesega i le va o PCR tubes ma tubes e mafua mai i mea sese PCR dosing.O le 20 × ROX Reference Dye concentration e manaʻomia mo meafaifaʻaili eseese e ese, ma e mafai e le tagata faʻaoga ona faʻaopoopoina e tusa ai ma le faʻatonuga fautuaina o le meafaigaluega.

RNase-Free ddH₂O: RNase e leai se vai fa'ama'i mama mama mo la'asaga lua RT-qPCR tali.

Fa'aeteetega:(Ia mautinoa e faitau ma le faaeteete le puipuiga aʻo leʻi faʻaaogaina le pusa)

Fa'alogo lelei i le faiga o le fa'ata'ita'iga e 'alofia ai le fa'a'ese'esega i le va o fa'ata'ita'iga.

Fa'alogo lelei ile mama ole si'osi'omaga fa'ata'ita'i ma ipu e 'alofia ai le fa'aleagaina ole RNase ma le fa'aleagaina ole RNA.

Ave ni fa'ata'ita'iga sela fou pe fa'asao lelei ma 'aua ne'i toe fa'aogaina fa'ata'ita'iga sela fa'a'aisa fa'a'aisa.

5× Direct qPCR Mix,2× Direct qPCR Mix-Taqman e tatau ona aloese mai le toe fa'a'aisa-liu, a leai o le a afaina ai le fa'aliliuina o tusitusiga ma le lelei o le PCR.

Sauniunigamea'aimuamuafa'agaioiga

Ia mautinoa e faitau lelei faatonuga a'o le'i fa'aogaina lenei pusa.Ole Cell Direct RT-qPCR Kit e faigofie, faigofie, ma vave ona faʻaogaina, ma o faʻatonuga e maua ai faʻamatalaga atoatoa e uiga i le pusa atoa ma le faʻaogaina saʻo.Fa'amolemole sauni mea fa'ata'ita'i mana'omia ma meafaigaluega a'o le'i fa'aogaina.

Mea fa'ata'ita'i ma meafaigaluega

◆ sela faʻaleaganuʻu.

◆ 1.5 ml poʻo le 2 ml, RNase-/DNase-Free centrifuge tube, RNase-/DNase-Free pito, 0.2 ml sterile qPCR tube.

◆ masini qPCR, paipa, centrifuge laulau (≥13,400×g) (faʻalagolago i manaʻoga faʻataʻitaʻi), ma isi.

Saogalemu

◆ O lenei oloa e mo naʻo suʻesuʻega faʻasaienisi, faʻamolemole aua neʻi faʻaaogaina mo vailaʻau, falemaʻi, meaʻai ma mea teuteu.

◆ Pe a faʻaaogaina vailaʻau, fai lavalava talafeagai ile fale suesue, totigilima, mata tioata puipui, ma isi.

Fa'agaioigataiala

Cell Lysis system, RT system, ma qPCR reaction solution fa'aopoopo fa'apipi'i e mafai ona fa'atau ese'ese, mo fa'amatalaga i le Fa'aopoopoga 1 (IUULAU 13).

Fa'atonuga o galuega

A: Fa'ata'ita'iga RNA fa'amalolo

1.Cells na mua'i togafitia: Fufulu le ipu aganu'u sela i le malulu PBS, ona lyse sela (10-10⁶), 10⁶ nai lo le aofaʻi o sela, ua fautuaina Foregene le Cell se RNA Isolation Kit le Aofaʻi (DE-03111) poʻo Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) mo le RNA faʻamama ma le faʻamamaina.

1.1.sela pipi'i (24-well plate e fai ma fa'ata'ita'iga)

1.1.1.Fua le numera o sela i totonu o vaieli taitasi, fuafua o le numera o sela e 1 × 10⁵, ma fa'aaoga se paipa e aveese ai le mea tau aganu'u mai le ipu fa'aleaganu'u.

1.1.2.Fa'aopoopo le 200 μl o le 1 × PBS na mua'i malulu i vaieli ta'itasi.Aua le paipa faafia ma aveese le PBS mai vaieli.Su'e le ipu ma aveese le tele o le PBS pe a mafai.Fa'aauau i le Laasaga 2.

1.1.3.Eseese ipu aganu'u aganu'u po'o se numera fa'asino numera 1-1 i totonu o se ipu fa'aleaganu'u ipu ua fa'aopoopo muamua 1 × PBS mo le fufuluina o sela.

Laulau1-1: fua ole PBS mo numera eseese o sela

Manatua：Ina ia mautinoa se sela pipii mau,le tele o sela e leiloa pe a fufulu .

1.2.O sela taofi po'o sela pipi'i e fa'atupu i totonu o ipu e le porous

1.2.1.O sela pipii o lo'o fa'atupuina i totonu o le tele o ipu lelei (sela taofi e amata mai le isi laasaga 1.2.2), aoina ma tu'ueseese sela e tusa ai ma le auala masani o le aoina o sela, ma tu'u i totonu o se ipu fa'aleaganu'u po'o se fa'aau centrifuge;afai e fa'aogaina le trypsinization, mana'omia le centrifugation e aoina ai sela ma aveese ai le trypsin totoe, fa'aopoopo i ai le PBS toe fa'asaoina sela i sela ta'itasi e ta'ape ai sela.

1.2.2.A maeʻa le numera o sela na faitauina, faʻafeiloaʻi sela 1x10⁵ tasi e centrifuge tubes, aoina sela e centrifugation i 1000 × g mo 10 min.

1.2.3.Faaopopo le 200 μl PBS i le faagaau centrifuge, aua le paipa faafia, ma saʻo saʻo le PBS.Faʻaauau i le Laasaga 2. (Afai e faigata ona faʻafefe ma toe faʻamalo le sela, e mafai ona faia 1000 × g centrifuged 10 min pe a uma ona lafoaʻi le supernatant, o le pellet cell e alu i le Laasaga 2)

2.Cell lysis: Aveese Buffer CL, lona vevela equilibrated i le vevela potu, DNA Eraser ma Foregene Protease Plus II, e tusa ai ma le laulau o loʻo i lalo 1-2 saunia lysis system: (Lysis solution ua sauni mo le faʻaaogaina).

Laulau1-2: vaeluaga tapenaga faiga (Manatua: ile sauniuniga ile aisa)

3.( 24 –well plate e fai ma faʻataʻitaʻiga) Pipette 200 μl o le cell lysis master faʻafefiloi i totonu o vaieli taʻitasi, Faʻaauau pea ona feula 5-10 taimi, Incubate i le vevela o le potu (20-25 ℃ ) mo le 5 min.

Manatua：Ina ia aloese mai le fausia o bubbles, faamolemole pe a fetuunai paipa paipa fua i le 200μl pe itiiti.O sela e ono foliga faanenefu pe a uma le lysis, lea e masani ai.

4. (24 –well plate e fai ma faʻataʻitaʻiga) ua faaopoopo i le vai 20 μl Buffer ST (eseese lysis systems Buffer ST faaopoopo i se aofaiga o loʻo faʻaalia i le Laulau 1-3), toe fai pipetting 5-10 taimi, i le vevela o le potu (20-25 ℃) na faʻatupuina mo le 2 min.

Manatua：O le pito paipa e lafo i lalo ole luga, faʻamautinoa ua faʻaopoopo le lysate,ina ia aloese mai le fausia o bubbles, faamolemole pe a fetuunai paipa paipa fua i le 200μl pe itiiti.

Laulau 1-3：Fa'aopoopo le Buffer ST

5.O le lysate e faʻaaogaina mo suʻega RT-qPCR mulimuli ane.Afai e le mafai ona faia su'esu'ega mulimuli ane, fa'amolemole tu'u i luga o le aisa mo le sili atu i le 2 itula, ma teu i le -20 ℃ po'o le -80 ℃ (le silia ma le tolu masina).

B: RT tapenapenaga faiga

1. Ave ese 5 × Direct RT Mix ma tuu i luga o se taele aisa, ia liusuavai masani, ma faʻafefiloi malie mo le faʻaaogaina mulimuli;ave i fafo RNase-Free ddH2O ma liusuavai ma tuu i luga o le ta'ele aisa mo le fa'aoga mulimuli.Sauni le faiga o tali i luga ole aisa e tusa ai ma le Laulau 2-1 o lo'o i lalo.

Fuafuaga 2-1: Sauniuniga o le RT reaction system

2. Ina ua maeʻa le faʻatulagaina o faiga, faʻafefiloi malie ma centrifuged puupuu i le laulau o loʻo mulimuli mai 2 -2 tulaga tali RT tali.

Fuafuaga 2-2: RT Fa'atulagaina o tulaga

3. Ina ua maeʻa le tali, na tuʻu saʻo le oloa tali i luga o le aisa mo qPCR, faʻamolemole tuʻu le faʻasao umi -20 ℃ poʻo le -80 ℃ .

Fa'aaliga: Ona o le fa'aogaina o fa'ata'ita'iga e le'i fa'amamāina, e ono aliali mai ni pa'epa'e pa'epa'e i le mea fa'aliliu fa'aliliu.O se mea masani lea.Centrifuge le supernatant vave mo su'esu'ega mulimuli ane.

Ole tali ole tali ole RT ua fa'aopoopoina ile isi Laasaga Real Time PCR reaction system, e fautuaina e fa'aopoopo le aofa'i mai le 10-30% ole faiga fa'afoliga.

C: qPCR faiga fa'afoliga tapenaga

1. Ole aofaiga talafeagai ole B ua saunia ile la'asaga cDNA fa'ata'ita'iga e tusa ai ma le siata 3-1 o lo'o i lalo e saunia ai se faiga fa'afoliga.

Fa'aaliga: O le aofa'i o fa'ata'ita'iga cDNA e fa'atatau i le 10-30% ole faiga qPCR.Mo se faʻataʻitaʻiga, i le 20μl qPCR system, faʻaopoopo le 2-6 μl o le lysis buffer, ae le sili atu i le 6 μl.

2. Le optimization tulaga lelei qPCR (Annealing vevela，etc.) mo qPCR tali (O tulaga tali tuuina atu i le Laulau 3-2).

Fa'aaliga: Taumafai e fa'aoga tulaga sili ona lelei mo tali qPCR e maua ai fa'ai'uga lelei.

Siata 3-1: Sauniuniga o le PCR reaction system

1*: E mafai ona fetuutuuna'i le fa'atonuga muamua i le va o le 50-900 nM pe a le lelei le fa'atinoga o tali muamua.

Fa'aaliga: E mafai ona fetu'una'i le faiga o le qPCR e tusa ai ma mana'oga fa'ata'ita'i ma fa'ata'ita'iga fa'ata'amilosaga fa'alelei.Mo le qPCR ile 50μl faiga, fetuutuunai le fua o le reagent e tusa ai ma le 20μl faiga.

2*: Filifili le fa'atonuga mulimuli talafeagai o le ROX Reference Dye e tusa ai ma le fulafula quantitative thermal cycler.Ole fa'atatauga ole lanu ole Fa'asinomaga ROX e sili ona talafeagai mo ta'avale fa'afuainumera masani ole fa'ase'e o lo'o fa'aalia ile laulau i lalo:

Fuafuaga 3-2: qPCR tulaga tali atu ua saunia

Fa'aaliga: Ina ia maua le a'afiaga o le qPCR sili, e mafai ona fa'aogaina le gradient PCR e fa'amalieina ai tulaga fa'aalia mo fa'ata'ita'iga 'ese'ese ma fa'amata'aga eseese.tulaga tali PCR eseese e faalagolago i luga o le fluorescence analyzer, template, primer, ma isi. I le faagaoioiga patino, e tatau ona fuafuaina tulaga tali sili ona lelei e tusa ai ma tulaga patino o le fluorescence quantitative thermal cycler, ituaiga mamanu, tele o le vaega o le tului, faasologa faavae o le vaega amplified ma GC anotusi ma le umi o primers, e aofia ai le vevela annealing, taimi tali, ma isi.

Taimi Moni PCR fa'avae mamanu fa'avae

Fa'aimua Fa'asaga i luma ma Fa'ailoga Fa'asaga

Mo PCR Taimi Moni, e taua tele le mamanu muamua.Primers e fesoʻotaʻi ma le faʻapitoa ma le lelei o le PCR faʻalauteleina, ma e mafai ona mamanuina e faʻatatau i mataupu faavae nei:

◆ Ulua'i umi: 18-30bp.

◆ GC anotusi: 40-60%.

◆ Tm tau: Primer design software, pei o le Primer 5, e mafai ona tu'uina atu le tau Tm o le fa'avae.Ole tau Tm ole pito i luga ma lalo e tatau ona latalata ile mea e mafai ai.E mafai foi ona fa'aoga le fua fa'atatau Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Pe a faia le PCR, o le vevela i lalo ifo o le tau Tm muamua o le 5 °C e masani ona filifilia e avea ma vevela faʻapipiʻi (o le siʻitia tutusa i le vevela faʻafefe e mafai ona faʻateleina le faʻapitoa o le tali PCR).

◆ Primers ma PCR oloa:

◆ Fuafuaga muamua PCR amplification umi oloa e sili e 100-150bp.

◆ E tatau ona 'alo'ese mai mea fa'apitoa i le vaega lona lua o le fa'ata'ita'iga i le tele e mafai ai.

◆ Aloese mai le fausia o faavae lagolago e 2 pe sili atu i le va o pito 3′ o pito i luga ma lalo.

◆ Primer 3′ e le mafai ona iai ma le 3 fa'aopoopo G po'o le C.

◆ E le mafai ona iai ni fausaga fa'aopoopo i fa'auluuluga, a leai o le a fausia se fausaga fa'aulu, e a'afia ai le fa'alauteleina o le PCR.

◆ ATCG e tatau ona tufatufa tutusa i le faasologa muamua, ma le 3′ fa'avae fa'amau e tatau ona aloese mai le T.

Fa'aopoopo1：Cell DirectRT-qPCR Pusa vaegat pusa faaopoopo

1.Cell Lysis Fofo