1. Malamalama muamua
I lenei laasaga, e tatau ona tatou malamalama i nisi o manatu ma faaupuga, ina ia aloese mai le faia o mea sese i luma o tatou matutua, e pei o:
Q: O le a le eseesega i le va o le RT-PCR, qPCR, Real-time PCR, ma le taimi moni RT-PCR?
Tali: RT-PCR o le fa'aliliuina o le PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR), o se fa'aogaina lautele o le polymerase chain reaction (PCR).I le RT-PCR, o le RNA strand e toe faʻaliliuina i le DNA faʻaopoopo, ona faʻaaogaina lea e fai ma faʻataʻitaʻiga mo le faʻalauteleina o le DNA e le PCR.
Taimi moni-PCR ma qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) o le mea lava lea e tasi, o mea uma ia e lua o le PCR quantitative taimi moni, o lona uiga o taʻamilosaga taʻitasi o le PCR o loʻo i ai faʻamaumauga faʻamaumauga moni, o lea e mafai ai ona fetuunai le numera o faʻataʻitaʻiga amata suʻesuʻega saʻo.
E ui lava ina foliga faapuupuuina le PCR Real-time ( real-time fluorescent quantitative PCR) ma Reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) e pei o le RT-PCR, o le tauaofiaga faavaomalo o le: RT-PCR e faasino tonu i le faʻaliliuina o tusitusiga.PCR, PCR taimi moni e masani ona faapuupuuina o le qPCR (quantitative real-time PCR).
Ma o le taimi moni RT-PCR (RT-qPCR), O le faʻaliliuga transcription PCR tuʻufaʻatasia faʻatasi ma le tekonolosi quantitative fluorescent.: muai maua le cDNA (RT) mai le RNA toe fa'aliliuina, ona fa'aaoga lea o le PCR moni mo le su'esu'ega fa'atatau (qPCR).Ole tele o fale su'esu'e e fai le RT-qPCR, o lona uiga, su'esu'ega ile RNA expression down-regulation, o le qPCR lea e talanoa ai tagata uma ile falesuesue e faasino tonu ile RT-qPCR, ae aua nei galo o loʻo i ai pea le tele o suʻega DNA i totonu ole falemaʻi.Su'esu'ega fa'atatau, pei ole fa'ama'i hepatitis B HBV su'esu'ega.
Fesili: A maeʻa ona faitau le tele o le PCR faʻateleina, aisea e tatau ai ona pulea le vaega faʻateleina i totonu ole va o le 80-300bp?
Tali: O le umi o faʻasologa o kenera taʻitasi e eseese, o nisi e tele kb, o nisi e selau o bp, ae naʻo tatou manaʻomia le umi o le oloa e 80-300bp pe a mamanuina primers, e puupuu tele pe umi tele e le talafeagai mo le suʻesuʻeina o le PCR fluorescent quantitative .O le vaega o oloa e pu'upu'u tele e fa'aeseese ai mai le primer-dimer.O le umi o le primer-dimer e tusa ma le 30-40bp, ma e faigata ona iloa pe o se primer-dimer poʻo se oloa pe afai e itiiti ifo i le 80bp.Afai o le vaega o oloa e umi tele, e sili atu i le 300bp, o le a faigofie ona taʻitaʻia i lalo ole faʻaleleia lelei ma e le mafai ona iloa lelei le aofaʻi o le gene.
Mo se fa'ata'ita'iga, a e faitau pe to'afia tagata o lo'o i totonu o le potua'oga, e tatau ona e faitau pe fia ni gutu.E tutusa lava le moni pe a e mauaina kenera, naʻo lou manaʻomia e suʻeina se faʻasologa o se kenera e fai ma sui O le faasologa atoa o le a faia.Afai e te manaʻo e faitau tagata, e tatau ona e faitauina uma gutu ma isu, taliga, ma tioata, ma e faigofie ona fai mea sese.
Ina ia faʻalauteleina, i suʻesuʻega faʻaola, e tele mataupu suʻesuʻe mai lea itu i lea eria, ona o le faasologa o kenera o soʻo se ituaiga e umi tele, e le manaʻomia ma e le mafai ona fuaina vaega uma, e pei o le siama 16S sequencing, o le faia lea o le faʻasologa faʻasolosolo o siama Suʻega e faʻamaonia ai le numera o se faitau aofaʻi o siama.
Q: O le a le umi sili ona lelei mo le mamanu muamua o le qPCR?
Tali: I se tulaga lautele, o le umi muamua e tusa ma le 20-24bp, lea e sili atu.O le mea moni, e tatau ona tatou gauai atu i le tau TM o le mea muamua pe a mamanuina le mea muamua, aua o lenei mea e fesoʻotaʻi ma le vevela sili ona lelei.A maeʻa le tele o faʻataʻitaʻiga, ua faʻamaonia o le 60 ° C e sili atu le tau TM.Afai e maualalo tele le vevela o le annealing, o le a faigofie ona taʻitaʻia ai le faʻalauteleina o le le faʻapitoa.Afai e maualuga tele le vevela o le faʻafefe, o le a faʻaitiitia le faʻaleleia atili, o le tumutumu o le faʻasolosolo faʻasolosolo o le a amata mulimuli ane, ma o le a tuai le tau o le CT.
Q: E fa'afefea ona ese le auala vali mai le metotia su'esu'e?
Tali: auala valiO nisi o lanu felanulanua'i, e pei ole SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ma isi, e le fa'amalama e i latou lava, ae o le a fa'aosoina le felanulanua'i pe a uma ona pipii i le tootoo la'ititi o le DNA fa'alua.O le mea lea, i le amataga o le PCR tali, e le mafai e le masini ona iloa le faailo o le fluorescent.A oʻo atu le tali i le tulaga faʻapipiʻi-faʻaopoopoga, e tatalaina le manoa faʻalua, ma faʻapipiʻiina se manoa fou i lalo o le gaioiga a le DNA polymerase, ma o loʻo fusifusia le mole mumu i le dsDNA laʻititi laʻititi.A'o fa'atupula'ia le aofa'i o ta'amilosaga PCR, o lo'o tu'ufa'atasia le tele o vali fa'atasi ma le DNA fa'alua, ma fa'apena fo'i le fa'aleleia atili o le fa'ailo fa'alelei.Ole auala vali e masani ona fa'aoga ile su'esu'ega fa'asaienisi.
PS: Faʻaeteete pe a fai le faʻataʻitaʻiga, e tatau ona tuʻufaʻatasia le vali ma le DNA o le tagata, faʻaeteete e liliu i se tagata fluorescent.
Metotia vali (agavale) Metotia su'esu'e (taumatau)
PS: Faʻaeteete pe a fai le faʻataʻitaʻiga, e tatau ona tuʻufaʻatasia le vali ma le DNA o le tagata, faʻaeteete e liliu i se tagata fluorescent.
SYBR Green Ⅰ e fusifusia i le tootoo laiti o le DNA
Metotia su'esu'eOle su'esu'ega Taqman ole su'esu'ega fa'asusu e sili ona fa'aaogaina.O lo'o i ai se vaega fa'alelei i le 5' pito o le su'esu'ega, e masani lava FAM, ma o le su'esu'ega lava ia o se fa'asologa e fa'aopoopo i le kenera fa'atatau.O lo'o i ai se vaega fa'amumu fa'amalama i le pito 3'.E tusa ai ma le mataupu faavae o le faʻaleleia o le mafai ona suia le malosi o le malosi o le malosi Lekle, a o le autoflurescence ua vaivai.O le mea lea, i le amataga o le PCR tali, pe a leai se su'esu'ega ma atoatoa i totonu o le faiga, o le a le fa'aosoina e le vaega fa'amalama talatala.A mae'a, e fusifusia le mea muamua ma le su'ega i le mamanu.I le taimi o le faʻaopoopoga, o le polymerase faʻaauau ona faʻapipiʻi filifili fou.O le DNA polymerase e iai le 5′-3′ exonuclease gaioiga.A o'o atu i le su'esu'ega, o le DNA polymerase o le a fa'a-hydrolyse le su'esu'ega mai le fa'ata'ita'iga, tu'u'ese'ese le vaega fa'amalama fa'asalalau mai le vaega fa'amalama fa'amae'a, ma fa'amatu'u le fa'ailo fa'amalama.Talu ai o loʻo i ai se vaʻaiga tasi-i-tasi i le va o le suʻega ma le faʻataʻitaʻiga, o le auala suʻesuʻe e sili atu nai lo le auala vali i tulaga o le saʻo ma le maaleale o le suʻega.O le auala su'esu'e e masani ona fa'aaogaina i su'esu'ega.
Q: O le a le fa'atatauina atoatoa?O le a le Relative Quantification?
Tali: Fuafuaga atoatoa e faasino i le fa'atatauina o le numera kopi muamua o le fa'ata'ita'iga e su'eina e le qPCR, pei o le aofa'i o siama HBV o lo'o i totonu ole 1ml o le toto.O le fa'ai'uga e maua i le fa'atusatusaga fa'atatau o le suiga lea i le aofa'i o le kenera fa'atatau i se fa'ata'ita'iga fa'apitoa e feso'ota'i ma se isi fa'ata'ita'iga fa'asino, ma o le fa'aaliga o le kene e fa'atulafonoina i luga po'o lalo.
F: Pe o le aofa'i o le RNA fa'atosina, fa'aliliuga lelei fa'aliliuga, ma le fa'asili fa'asili ona a'afia ai i'uga fa'ata'ita'iga?
F: E a'afia ea fa'ai'uga fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga fa'aputuina, fa'ato'a fa'a'ese'esega, fa'aliliuga fa'aliliuga fa'aliliu, ma mea fa'aaogaina moli?
Q: O le a le auala e mafai ona faʻasaʻo ai faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga?
E tusa ai ma nei mataupu, o le a matou faʻamatalaina auʻiliʻili i vaega o loʻo i lalo.
2. Malamalama maualuga
E tusa ai ma le PCR fa'ata'ita'i fa'aola i le taimi moni, e tatau ona tatou iloa le moni o le faitau afe o pepa su'esu'e fa'asaienisi o lo'o lomia i tausaga ta'itasi, ma e le'o se numera la'ititi le fa'atekonolosi fa'afuainumera PCR.
Afai e leai se tulaga masani e fua ai le su'esu'ega PCR fa'ata'ita'i fa'alelei, e ono fesuisuia'i fa'ai'uga.Mo le kenera lava e tasi o ituaiga e tasi, faatasi ai ma le auala e tasi e gaosia ai, o taunuuga e iloa ai o le a eseese tele foi, ma o le a faigata mo tagata tuai ona toe faia ia lava taunuuga tutusa.Oe E leai se tasi na te iloa le mea sa'o ma le mea e sese.
O lona uiga o le PCR fa'ata'ita'i fa'alelei ose tekonolosi fa'atau po'o se tekonolosi e le fa'atuatuaina?Leai, e mafua ona e sili atu ona maaleale ma sili atu le saʻo o le PCR fluorescent quantitative, ma o sina gaioiga sese e maua ai iʻuga faʻafeagai atoatoa.O se gau itiiti e afe maila le mamao.O le tusitala o le tusiga e mafai ona faʻasalaina soo e le au suʻesuʻe.I le taimi lava e tasi, o tagata suʻesuʻe o le tusi talaaga e faigata foi ona filifili mai iʻuga faʻataʻitaʻiga eseese.
I mea uma, faʻasino i le leai o se maliega i suʻega PCR taimi moni.I lenei tulaga, o saienitisi sinia i le alamanuia na amata ona faʻatulagaina tulaga,mana'omia tagata fai sao e tu'uina atu nisi fa'ata'ita'iga talafeagai ma fa'amatalaga fa'amaumauga (e aofia ai fa'amaumauga mana'omia) i totonu o le tusiga e ausia ai nei tulaga.
E mafai e tagata su'esu'e ona fa'amasino le lelei o le su'ega e ala i le faitauina o fa'amatalaga nei;e mafai foi e le au faitau i le lumanaʻi ona faʻaogaina lenei mea e toe fai ai le faʻataʻitaʻiga pe faʻaleleia le suʻega.Ona maua ai lea o faʻataʻitaʻiga iʻuga i lenei auala e tumu i faʻamatalaga, tulaga maualuga, ma faʻaaogaina.
MIBBI (Fa'amatalaga Fa'atauva'a mo Su'esu'ega Fa'aletino ma Biomedical -http://www.mibbi.org) na oo mai.O le MIBBI o se poloketi e tuʻuina atu faʻataʻitaʻiga mo suʻega.Ua lomia i le natura.O lenei poloketi o loʻo faʻatatau i suʻesuʻega faʻaola eseese, e aofia ai le biology cell, Microarray, qPCR o le a tatou talanoaina nei, ma isi, ma tuʻuina atu mo ituaiga faʻataʻitaʻiga taʻitasi pe a tuʻuina atu tusitusiga.O lena faʻamatalaga e tatau ona tuʻuina atu i taimi uma.
I totonu o le poloketi MIBBI, e lua tala e fesoʻotaʻi ma le PCR faʻataʻitaʻiga fluorescent, e taʻua:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – ose gagana fa'atulagaina ma ta'iala fa'asalalau mo fa'amaumauga PCR fa'atatau i taimi moni;
·MIQE (Faʻamatalaga Laʻititi mo Faʻasalalauga o Faʻataʻitaʻiga PCR Taimi Moni) - faʻamatalaga laʻititi mo le lolomiina o tala e uiga i faʻataʻitaʻiga PCR taimi moni.
Muamua, seʻi o tatou talanoa e uiga i le RDML, o faʻamatalaga faʻamatalaga.
Afai e leai se faʻamatalaga masani mo mea uma, e le mafai ona faʻaauau le talanoaga, o le mea lea e taua tele ai le faʻamatalaga o faaupuga i le suʻega.
O fa'aupuga o lo'o fa'aogaina i le su'ega PCR fa'ata'ita'i fa'asili e aofia ai mea nei.QIAGEN ua faia le aotelega sili mo i matou.O mea nei e mago umaoloa .
Pipi fa'aola
O le fa'aupuga fa'alautele e fa'atatau i le pupuni na faia i le faagasologa o le PCR, ma le numera o le taamilosaga e pei o le abscissa ma le malosi o le fluorescence i le taimi moni i le taimi o le tali e pei o le ordinate.
E tatau ona iai uiga nei o se fa'aupuga fa'alautele lelei: o le laina fa'avae e mafolafola pe fa'aitiitia teisi, ma e leai se tulaga fa'aalia i luga;e manino le mea fa'afefeteina o le pi'o, ma o le fa'ase'e o le fa'asologa fa'atele e fa'atatau i le fa'aleleia lelei.O le tele o le malifa, o le maualuga lea o le faʻaleleia atili;le fa'aupuga fa'apena lautele O le fa'atusa e lelei, e fa'aalia ai o le fa'aleleia lelei o paipa ta'itasi e tutusa;o le vaega fa'atuputeleina o le pupuni fa'alautele o fa'ata'ita'iga e maualalo le fa'atotonuga e iloagofie.
Fa'avae (Laina Fa'avae)
Ole laina fa'avae ole maualuga ole pisapisao ole taamilosaga muamua, e masani ona fuaina i le va o le 3rd ma le 15th cycle, ona o le faʻatupulaia o le tau o le fluorescence e mafua mai i le faʻalauteleina o oloa e le mafai ona iloa i lenei vaitau.Ole numera o ta'amilosaga e fa'aaoga e fa'atatau ai le laina fa'avae e mafai ona fesuia'i ma e ono mana'omia le fa'aitiitia pe a fa'aoga le aofa'i o fa'ata'ita'iga po'o le maualuga o le fa'aaliga o le kenera fa'atatau.
O le fa'atulagaina o le laina fa'avae e mana'omia ai le va'ai i fa'amatalaga o le fluorescence mai le fa'aupuga o le fa'alauteleina o laina.Ua fa'atulaga le laina fa'avae ina ia amata ai le fa'atuputeleina o le si'osi'omaga i se numera ta'amilosaga e sili atu nai lo le numera pito i luga.E mana'omia ona fa'atulaga ta'ito'atasi laina fa'avae mo fa'asologa fa'asologa ta'itasi.Ole fua ole fluorescence averesi e iloa ile taamilosaga muamua e tatau ona toesea mai tau ole fluorescence e maua i oloa faʻateleina.O lomiga lata mai o polokalame PCR Real-Time eseese e mafai ai ona fa'ata'ita'i fa'atomiga o fa'atulagaga fa'avae mo fa'ata'ita'iga ta'itasi.
I nai taamilosaga muamua o le PCR amplification reaction, o le faailo o le fluorescence e le suia tele.O le fa'alatalata atu i se laina sa'o e ta'ua o le laina fa'avae, ae a tatou va'ava'ai toto'a i nai ta'amilosaga muamua, tatou te va'ai i totonu o le laina fa'avae le mea o lo'o tupu i le ata o lo'o i lalo.
Fa'amatalaga Fa'amatalaga e fa'atatau i
le taua ole fluorescence e le fa'apitoa ile tali.Mo se fa'ata'ita'iga: le lelei o le tineia o le fluorescence;poʻo se numera tele o faʻataʻitaʻiga DNA faʻalua ona o le faʻaogaina o le SYBR Green.O vaega pito i tua o le faailo e aveese fa'amatematika e le Real-Time PCR software algorithm.
Faailoga a le tusitala
Fa'ailo fa'aitalafu e fa'atatau i le fa'ailo fa'amalama e fa'atupuina e le SYBR Green po'o fa'ailoga fa'ailoga fa'asolosolo fa'apitoa su'esu'ega ile taimi moni PCR.
Fa'ailoga Tusitala masani (RN)
RN o lo'o fa'atatau i le felanulanua'i malosi o le vali o le tusitala e vaevaeina i le malosi o le felanulanua'i o lo'o fuaina i ta'amilosaga ta'itasi.
Vale Fa'asinoga Passive
I nisi PCR taimi moni,o le lanu felanulanua'i ROX o lo'o fa'aaogaina e fai ma fa'asinomaga i totonu e fa'amanino ai le fa'ailoga fa'alelei.E fa'asa'o mo fesuiaiga ona o le le sa'o o le paipa, tulaga lelei, ma le fluorescence fela'ua'i i luga ole va'aiga lelei.
Le fa'auluuluga o le fa'amalama (threshold)
na fetuutuunai i luga a'e o le tau tua'oi ma matua'i lalo ifo o le tulaga maualuga o le fa'aupuga o le fa'alauteleina.E tatau ona taoto i le laina laina o le faʻalauteleina o pupuni, e fai ma sui o le log-linear range of PCR detection.E tatau ona fa'atūina fa'ailoga i le va'aiga o le fa'aliga fa'aputuga o ogalaau ina ia fa'afaigofie ona iloa le la'asaga o le log-linear o le PCR.Afai e tele genes taula'i ile Real-Time PCR, e tatau ona seti le fa'ailoga mo sini ta'itasi .E masani lava, o le faailo o le fluorescence o le taamilosaga muamua e 15 o le PCR o loʻo faʻaaogaina e pei o le fluorescence background signal, ma o le fluorescence threshold e 10 taimi le eseesega masani o le fluorescence signal o le muamua 3 i le 15 cycles o le PCR, ma o le fluorescence threshold o loʻo faʻatulagaina i le vaega faʻateleina o le PCR amplification.I se tulaga lautele, o meafaifa'aili ta'itasi o lo'o i ai lona fa'auluuluga fa'ata'atia a'o le'i fa'aogaina.
Ta'amilosaga Ta'amilosaga (CT) po'o le Fa'asa'o (CP)
Le ta'amilosaga lea e sopoia ai e le pi'o fa'alautele le faitoto'a (fa'atusa, o le tulaga lea e fa'atupula'ia ai le su'esu'ega o le fluorescence).E mafai ona avea le CT ma se vaega ninii ma e mafai ona fuafua le aofa'i o le fa'ata'ita'iga amata.O le tau o le CT o lo'o fa'atusalia ai le aofa'i o ta'amilosaga e o'o i ai pe a o'o atu le fa'ailo fa'alelei i totonu o paipa tali PCR ta'itasi i le tulaga fa'atulagaina.O lo'o i ai se feso'ota'iga laina i le va o le tau CT o fa'ata'ita'iga ta'itasi ma le logarithm o le numera kopi muamua o le fa'ata'ita'iga, lemaualuga le numera muamua kopi, laʻititi le tau CT, ma le isi itu.E mafai ona faia se pupuni masani e ala i le faʻaaogaina o se faʻataʻitaʻiga ma le numera kopi muamua, lea o le abscissa o loʻo faʻatusalia ai le tau CT, ma o le ordinate e faʻatusalia le logarithm o le numera kopi muamua.O le mea lea, o le umi lava e maua ai le tau o le CT o le faʻataʻitaʻiga le iloa, o le numera kopi muamua o le faʻataʻitaʻiga e mafai ona fuafua mai le faʻasologa masani.
ΔCT tau
ΔCT tau faʻamatalainale ese'esega i le va o le kenera fa'atatau ma le fa'atatau o le kenele fa'asinomaga i totonu ole CT tau, e pei o se fa'ameamea ile fale, ma e fa'aoga e fa'avasega le aofa'i o fa'ata'ita'iga fa'aaoga:
⇒ΔCT = CT (ga'o fa'atatau) - CT (gane fa'asinomaga endogenous)
ΔΔCT Taua
O le tau o le ΔΔCT o loʻo faʻamatalaina ai le eseesega i le va o le uiga ΔΔCT tau o se faʻataʻitaʻiga o tului (faʻataʻitaʻiga, sela faʻaosofia) ma le uiga ΔΔCT faʻatatau o se faʻataʻitaʻiga (faʻataʻitaʻiga, sela e le faʻamalosia).O le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga e taʻua foi o le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga ma isi faʻataʻitaʻiga uma e masani i lenei mo le faʻatusatusaga faʻatusatusa:
⇒ΔΔCT = averesi ΔCT (faʻataʻitaʻiga o tului) - averesi ΔCT (faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga)
Endogenous reference genes (genes reference genes)
Ole maualuga ole fa'aaliga ole kenera fa'asinomaga, e pei ole genes tausi fale (genes housekeeping), e leai se eseesega i le va o fa'ata'ita'iga.O le fa'atusatusaina o le fa'atatau o le CT o le kenera fa'asino i le kenera fa'atatau e mafai ai ona fa'amanino le maualuga o le fa'aaliga o le kenera fa'atatau i le aofa'i o le RNA po'o le cDNA (silasila i le vaega ile ΔCT tau i luga).
Fa'asinomaga fa'alotoifale sa'o moe ono fa'aleagaina le RNA po'o le i ai o le enzyme inhibitors i fa'ata'ita'iga RNA, fa'apea fo'i suiga i totonu o le RNA, fa'aliliuga lelei fa'aliliuga, toe fa'aleleia o le nucleic acid, ma le fa'ata'ita'iina o fa'ata'ita'iga.Ina ia filifilia le kenera sili ona lelei (s), matou te suia le algorithm e faʻatagaina ai lona filifilia o le faʻamatalaga sili ona lelei e faʻalagolago i le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga.
Pulea totonu
Ose fa'asologa fa'atonu e fa'ateleina i le tali tutusa e pei o le fa'asologa fa'atatau ma su'esu'e i se isi su'esu'ega (fa'ata'ita'iga, faia o le PCR fa'alua).E masani ona fa'aogaina fa'atonuga fa'alotoifale e fa'asa'o ai fa'aliga fa'aletonu, e pei o le taimi e le'i iloa ai le fa'asologa fa'atatau.
Fa'ata'ita'iga Fa'ata'oto
O se fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga (fa'ata'ita'iga, RNA fa'amamāina mai se laina sela po'o se mea'ai) fa'aaogā i fa'atusatusaga fa'atusatusa e fa'atusatusa ai isi fa'ata'ita'iga uma e iloa ai le maualuga o fa'aaliga o se kene.O le fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga e mafai ona fai so'o se fa'ata'ita'iga, ae e masani lava o se fa'atonuga (mo se fa'ata'ita'iga, se fa'ata'ita'iga e le'i togafitia po'o se fa'ata'ita'iga mai le taimi e leai ai le su'ega).
Pule lelei
fa'aaoga tali fa'atonutonu maaofa'i o fa'ata'ita'iga ua iloa.O fa'atonuga lelei e masani ona fa'aoga e siaki ai pe o lo'o galue lelei se seti muamua po'o se seti su'esu'e ma o lo'o fa'atulaga sa'o le tali.
Leai se Pule Fa'ata'ita'i (NTC)
O se fa'atonuga fa'atonu o lo'o i ai vaega mana'omia uma o le fa'atupu fa'ateleina se'i vagana le fa'ata'ita'iga, lea e masani ona sui i le vai.O le faʻaogaina o le NTC e mafai ona maua ai le faʻaleagaina e mafua mai i le faʻaleagaina o le reagent poʻo le DNA mai fafo, ma faʻamautinoa ai le moni ma le faʻamaoni o faʻamatalaga suʻesuʻe.O le fa'ateleina ole fa'atonutonu ole NTC e fa'ailoa ai le fa'aleagaina.
Leai se pule RT (NRT)
O le fa'agasologa o le RNA e mafai ona aofia ai le DNA genomic toega, lea e matua leaga lava ma o le tagata solitulafono e a'afia ai le lelei o fa'amaumauga ma le fili fa'anatura o le qPCR, o le mea lea pe a fa'ata'ita'i su'esu'ega, e tatau ona mamanuina e fa'ateleina le su'esu'eina o le RNA.E lua auala, tasi o le mamanuina o primers i totonu o introns, o le isi e aveese atoa le DNA, o le fea e sili atu, lea o le a talanoaina mulimuli ane.Ole pule ole NTR ose fa'ata fa'ataulāitu e iloa ai le fa'aleagaina ole DNA.Afai e i ai le faʻalauteleina, o lona uiga o loʻo i ai le filogia.
Tulaga
O fa'ata'ita'iga o fa'ata'ita'iga o fa'atonuga iloa po'o numera kopi o lo'o fa'aaogaina e fausia ai se pi'o masani.Ina ia mautinoa le mautu o le tulaga masani, o le vaega o le gene e masani ona faʻapipiʻiina i totonu o le plasmid ma faʻaaogaina e fai ma faʻataʻitaʻiga.
O le pi'o masani
e masani ona diluted i le itiiti ifo i le 5 gradients concentration ma le oloa masani e tusa ai ma le fua faatatau faaluaina, ma 5 togi e tosoina i le faamaopoopoina o le tau CT ma numera kopi, ma ua fesootai manatu e fausia ai se laina e maua ai se pioga masani.Mo ta'amilosaga ta'itasi ta'itasi, e mana'omia ona siaki lona fa'amaoni.O le tau o le malifa e pa'ū i le va o le -3.3 ma le -3.8, ma o faʻatonuga taʻitasi e faia i faʻatolu.O manatu e matua'i ese mai isi manatu e tatau ona lafoa'i.O le tau o le CT o le faʻataʻitaʻiga e faʻataʻitaʻiina e aumai i totonu o le faʻasologa masani, ma o le faʻaaliga maualuga o le faʻataʻitaʻiga e faʻataʻitaʻiina e mafai ona faʻatatauina.
O le tau o le CT o le faʻataʻitaʻiga e faʻataʻitaʻiina e aumai i totonu o le faʻasologa masani, ma o le numera kopi muamua o le faʻataʻitaʻiga e faʻataʻitaʻiina e mafai ona faʻatatauina.
Malosiaga ma le Fa'ase'e
O le fa'ata'amilosaga o le fa'asologa masani e fa'atusalia le lelei o le PCR taimi moni.
· O le fa'ase'e o le -3.322 o lo'o fa'aalia ai o le PCR fa'ateleina le lelei o le 1, po'o le 100% lelei, ma le aofa'i o oloa PCR fa'aluaina i ta'amilosaga ta'itasi.
· O se fa'alili e itiiti ifo i le -3.322 (fa'ata'ita'iga, -3.8) e fa'aalia ai le lelei o le PCR.
· O le fa'asili e sili atu i le –3.322 (fa'ata'ita'iga, -3.0) e fa'ailoa mai ai e foliga mai e sili atu le lelei o le PCR nai lo le 100%, e fia iloa, fa'afefea ona fa'atupuina e se tasi ta'amilosaga o le PCR le sili atu nai lo le fa'aluaina o le oloa fa'ateleina?O lenei tulaga e tupu i le vaega e le o laina ole PCR tali, o lona uiga, o loʻo i ai se aofaʻiga tele o le faʻalauteleina e le faʻapitoa.
liu liusuavai
A maeʻa le faʻalauteleina o le qPCR, e faʻamafanafanaina le oloa PCR.A'o si'itia le vevela, e faasolosolo malie lava ona liusuavai le oloa fa'apipi'i fa'alua, ma fa'aitiitia ai le malosi o le fluorescence.A oʻo i se vevela faapitoa (Tm), o le a faʻafefeteina le tele o oloa.E pa'ū tele le felanulanua'i.O oloa PCR eseese e eseese Tm tau ma eseese vevela vevela, ina ia mafai ona iloa le patino o le PCR.
Li'u liusuavai
O le faʻafefete faʻafefete e maua mai e fausia ai se faʻafanua pito i luga, lea e mafai ona sili atu ona faʻaalia le tulaga o vaega o oloa PCR.Talu ai o le vevela o le liusuavai o le Tm tau o le vaega o le DNA, e mafai ona faʻamasinoina nisi o taʻiala e aʻafia ai le tau Tm o le vaega DNA, e pei o le tele o le vaega, GC content, ma isi.o le umi o le oloa faʻateleina o loʻo i le va o le 80-300bp, o le mea lea e tatau ona i ai le vevela o le liusuavai i le va o le 80 ° C ma le 90 ° C.
Fa'amatalaga o le liusuavai: Afai e na o le pau lava le tumutumu autu e aliali mai i le va o le 80°C-90°C, o lona uiga e atoatoa lelei le PCR quantitative fluorescent;afai o le tumutumu autu e aliali mai i le va o le 80°C-90°C ae o isi tumutumu e aliali mai i lalo ole 80°C, o le dimer muamua e manatu i ai.E mafai ona e taumafai e faʻateleina le vevela faʻafefe e foia ai;afai e aliali mai le tumutumu autu i le va o le 80°C-90°C, ma toe aliali mai le tumutumu eseese pe a oso aʻe le vevela, o lona uiga o loʻo i ai le faʻaleagaina o DNA, ma e manaʻomia ona aveese le DNA i le amataga o le suʻega.
O le mea moni, o loʻo i ai pea nisi o tulaga faʻalavelave, lea o le a talepeina taʻitasi i lalo.
3. Malamalama maualuga
Ina ia faia le qPCR, e tatau ona ou fai atu MIQE,Fa'amatalaga Laitimo Lomiga oFa'atelePCR taimi moniFa'ata'ita'iga—le fa'amatalaga la'ititi mo le fa'asalalauina o tala e uiga i le taimi moni o le PCRfa'ata'ita'iga .Ina ia faafaigofie le malamalama o tagata uma, o le a matou faafaigofieina mataupu autu.
E mafai ona e su'eina le ulua'i tusitusiga a le MIQE i luga ole Initaneti, ma o le mea e sili ona taua o lo'o fa'atonuina ai lelisi siaki faʻamaumauga e manaʻomia ona tuʻuina atu pe a lolomiina se tusiga .
E mafai e tagata su'esu'e ona fa'amasino le lelei o le su'ega e ala i le faitauina o fa'amatalaga nei;e mafai foi e le au faitau i le lumanaʻi ona faʻaogaina lenei mea e toe fai pe faʻaleleia le suʻega.
E taua le maitauina i lenei lisi, o le taua o lisi taʻitasi e faʻailogaina i le E poʻo le D.O le a le uiga?E: fa'amatalaga taua (e tatau ona tu'uina atu);D: fa'amatalaga mana'omia (tuuina atu le tele e mafai ai).
MIQE (1)—Mamanu Fa'ata'ita'i
O le tele o tagata ulavavale ua maeʻa a latou puipuiga pe a uma a latou aʻoga faʻauʻu o le a le iloa pe faʻapefea ona mamanuina se faʻataʻitaʻiga tutoatasi, tatala a latou api, ma fai le mea e taʻu atu e le faiaoga latou te faia.O le iʻuga, o le faʻataʻitaʻiga mamanu e leʻi faʻamalosi, ma na fai mai le matagaluega a le faatonu o le mekasini na latou mananaʻo e fai lenei ata ma lena ata, o lea na latou faia ai ma le le mautonu.O le ala lea e fai ai tagata ulavale!
E latalata i le fale, o le mataupu faavae muamua o le suʻega o le fuafuainale faigata o le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga.O le mea pito sili ona taua o le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga, ma o le mea pito sili ona taua e uiga i le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga o le faʻaogaina lea o le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga, faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga (pulea), ma le numera o toe fai, ina ia mafai ai ona faʻasino, faʻatusatusa, ma faʻamaonia faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga.
Le fa'ata'ita'iga fa'atataue faasino i le faʻataʻitaʻiga e manaʻomia ai ona tatou iloa le kenera taulaʻi pe a maeʻa se togafitiga.Le fa'ata'ita'iga fa'asinoo le faʻataʻitaʻiga e aunoa ma se togafitiga, lea e masani ona taʻua o le vao i le biology.
Fa'ata'ita'iga fa'atusae taua tele.E masani lava, e tatau ona sili atu i le tolu le aofa'i o fa'auiga fa'atosina.E mana'omia le va'aiga po'o le a le biological replication ma le a le technical replication.
Fa'asologa o Meaola: O le fa'ata'ita'iga fa'amaonia lava e tasi na faia i mea eseese (taimi, la'au, pa'u, ipu tali).
Fa'asologa o mea ola
Se'i fai ma fa'ata'ita'iga le togafiti fa'atosina o le pepa.Matou te mananaʻo e faʻapipiʻi vailaʻau faʻamaʻi i luga o laʻau e tolu o le ABC, ona tolu ai lea o laʻau e tolu o le ABC, ma o latou faʻataʻitaʻiga faʻamaonia tutusa na faia i mea eseese.Ae o se faʻataʻitaʻiga, e mautinoa lava e manaʻomia se faʻatonuga, ina ia mafai ona matou faʻafefeina se tasi o lala o le laʻau A e fai ai se vaega faʻataʻitaʻi o le laʻau A, ae le faʻafefeina isi lala o le laʻau A e fai ai se vaega e pulea.Fai tutusa mo B ma C.
Fa'amatalaga Fa'atekinisi: O se faʻataʻitaʻiga faifaipea ua fuafuaina e aloese mai mea sese e mafua mai i le faʻagaioiga, o le mea moni o se lua faʻalua o loʻo aofia i totonu o le mea lava e tasi.O togafitiga uma ma fa'atonuga e tatau ona iai fa'asologa fa'atusa (la'ititi tolu) o le kenera fa'atatau ma le kenera fa'asino i totonu.
Toe fai fa'atekinisi
Toe fai ma fa'ata'ita'iga le pepa ua togafitia i vailaau fa'asaina.Mo le vaega faataitai o le laau A, na matou faia ni pu PCR se tolu o le 1, 2, ma le 3 mo lona kenera taulaʻi ma le faʻasinomaga i totonu taʻitasi, ina ia ave le averesi pe a maeʻa le suʻesuʻeina.Mo le faʻatonutonuina o laʻau A E faʻapea foʻi ona faʻaogaina vaega i le auala lava e tasi.Fa'apena fo'i, fai le togafiti fa'apitoa mo la'au B ma C.Ole toe fai fa'atekinisi lea.
E taua le matauina o lena meao le a le mea e ulufale i fuainumera o le biological repetition, ma o le toe faia faʻapitoa o le suʻeina lea pe i ai ni faʻalavelave faʻafuaseʻi i le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga, ina ia mafai ai ona faʻamaonia taunuuga faʻataʻitaʻiga, o lona uiga, e aloese mai mea sese e ala i le ave o latou averesi e pei ona masani ona tatou fai atu ai.
Pule Leaga—NTC ma le NRT
NTC (Leai se Fa'ata'ita'iga Pulea), o se fa'atonuga e aunoa ma se fa'ata'ita'iga, e fa'aoga e fa'amaonia ai pe fa'aleaga mea fa'ata'ita'i.E masani lava, o le vai e faʻaaogaina e fai ma faʻataʻitaʻiga.Afai e iai se fa'afoliga fela'ua'i, e ta'u mai ai ua fa'aleagaina le nucleic acid i totonu o le falesu'esu'e.
O nei mea filogia e sau mai: vai le mama, reagents le agavaa o loʻo i ai DNA endogenous, faʻaleagaina muamua, faʻaleagaina mea faigaluega falesuesue, faʻaleagaina aerosol, ma isi, e manaʻomia le faʻaogaina o le RNase scavengers ma RNase inhibitors.Aerosol pollution e sili ona faigata ona maua.Va'ai faalemafaufau o lau falesu'esu'e e pei o le asu, ma le tele o nucleic acids o lo'o tautau i le ea.
NRT (No-Reverse Transcriptase), o le pulea e aunoa ma le faʻaliliuina o le faʻaliliuga, o le RNA e leʻi faʻaliliuina e avea o se pulega le lelei, o le pulea lea o le gDNA toega.
Pe a faia le faʻaaliga o le kenera, o le aofaʻi o le RNA e iloa e ala i le suʻeina o le aofaʻi o le cDNA pe a maeʻa faʻaliliuga.Afai ei ai le gDNA toega pe a faʻamamāina le RNA, o le a mafua ai mea sese i faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga, aua o taunuuga moni e maua o le gDNA ma le cDNA.I le tulaga faʻaopoopo, e le naʻo le cDNA, gDNA e manaʻomia ona aveese atoa ile taimi ole RNA.
MIQE (2)—faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga
O le mea e taʻua o faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga o lona uiga pe a matou lolomiina se tusiga e uiga i le qPCR, e tatau ona matou faʻamatalaina manino faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga, o se vaega taua o le tusiga.E faʻapea foʻi, pe a tatou faʻatautaia faʻataʻitaʻiga, e tatau foi ona tatou faʻatonutonu a tatou lava gaioiga e faʻamautinoa ai le faʻamaonia o faʻataʻitaʻiga.
O le faʻamatalaga o le faʻataʻitaʻiga ua naʻo se taunuuga, ma e tatau ona tatou gauai atili atu i mea na ave i le taimi o le suʻega atoa.
Filifiliga o mea fa'ata'ita'i
Fa'ata'ita'iga o le toto – filifili toto fou, ia le sili atu i le 4 itula.Fa'ata'ita'iga o sela - filifili e aoina sela fou i se vaitau o le tuputupu a'e malosi.Tissue Manu—Filifili aano fou, ola malosi.Tisu La'au – Filifili aano fou ma laiti.
Atonu na e matauina o loʻo i ai se upu autu i nai fuaiupu nei: fou .
Mo faʻataʻitaʻiga o loʻo i luga, o le pusa sili ona lelei, taugofie, ma mautu i luga o le maketi o le pusa a Foregene, lea e vave ma faigofie ona aveese mai a latou DNA ma RNA.
La'au Aofa'i RNA Isolation Kit
La'au Aofa'i RNA Isolation Kit Plus
Teuina o mea faataitai
I le tulaga masani, matou te le fautuaina le teuina o faʻataʻitaʻiga, pe a faʻatagaina tulaga.Peita'i, e to'atele uo e le mafai ona faia fa'ata'ita'iga i le taimi lava e uma ai le fa'ata'ita'iga, ma e mana'omia fo'i e nisi le la'u atu o tane nitomia vai i le fanua mo fa'ata'ita'iga.
Mo lenei ituaiga uo galue malosi, e mafai ona ou fai atu e te le malamalama i mea faʻaaogaina reagent.O le taimi nei o le tele o kamupani fa'atau fa'aaogaina e gaosia mea e mafai ona teu ai fa'ata'ita'iga RNA i le vevela o le potu, ma e mafai ona e filifili e fa'aoga.O le auala masani e teu ai o le teuina o le nitrogen vai, e faʻaaoga ai se tamaʻi tane vai e faigofie ona feaveaʻi.A mae'a ona toe fa'afo'i le fa'ata'ita'iga ile falesu'esu'e, teu i totonu ole pusaaisa -80°C.
Mo faʻataʻitaʻiga e aofia ai le RNA, e tatau ona mulimulitaʻia le mataupu faavae ono-upu:maualalo le vevela, leai ni enzymes,mavave .
O le manatu o le maualalo o le vevela e faigofie ona malamalama;e aunoa ma ni enzymes, o le RNase o loʻo i soo se mea i le lalolagi o loʻo tatou nonofo ai (a leai semanu e te fasiotia e le HIV), o le auala la e aloese ai mai le RNase pe a faia suʻega o se manatu taua tele;vave,E leai se Kung Fu i le lalolagi e le mafai ona motusia, na o le saoasaoa e le mafai ona motusia.
O le mea lea, i se isi itu, o le puʻupuʻu o le taimi e aveese ai, o le sili atu lea o le pusa.Aisea e fai aiForegeneO le pusa e faʻamamafa ai le saoasaoa, aua latou te iloa lelei.
PS: O nisi teine e fai fa'ata'ita'iga ma le fa'aeteete, ae e le lelei e pei o le slam dunk pe a mae'a le tele o tausaga o galuega.E latou te manatu e lē faamasinotonu le Atua, faitio i isi, ma saʻili mo le ola.O le mea moni, sa ia le malamalama i ai.Na te leʻi puipuia lelei le RNA, ma e toso le tagata taalo slam dunk.I le taimi na ia faia ai le suʻega, na ia manatu o le a ia faʻamaeʻaina le slam dunk i le faatolu, lima ma lua vaega, ae na ia faia lelei le suʻega.
Manatua: Faʻagesegese, sili atu avanoa o osofaʻiga RNase.E faʻafefea ona aʻoaʻoina oe lava ia vave?E leai se auala, na o le faataitai atili.
Mo faʻataʻitaʻiga eseese ma faʻataʻitaʻiga eseese, e manaʻomia pea le faitau atili o tusitusiga ma filifili se auala talafeagai mo le gaioiga.Mo le aoina ma le teuina o faʻataʻitaʻiga, e manaʻomia e le MIQE e tatau ona tusia manino i totonu o le pepa, ina ia mafai e le au suʻesuʻe ona toe iloilo le faʻamaoni o le pepa, ma e faigofie foi mo tamaiti maofa e toe fai lau suʻega.
E ui ina faigata su'esu'ega fa'aolaola, ae e maualuga.Afai e te le faaeteete, e mafai ona e fuli le lalolagi.Mo se faʻataʻitaʻiga, o le faia o le SARS i se faʻalavelave faʻaleagaina, poʻo le faia o araisa hybrid e faʻaola ai le 1.3 piliona tagata.O le ata o loʻo i lalo o se suʻesuʻega kemisi, e tatau ona e malamalama i lou mitamita i au suʻesuʻega i le naʻo le tilotilo atu i ona foliga e pei o titi.Ia galo, aua le faauliuliina o ia.
MIQE (3) – fa'aoso nucleic acid.
O le su'eina o le nucleic acid o se fa'alavelave tele, ma o su'esu'ega mole biology uma e amata ile su'ega nucleic acid.Muamua, se'i o tatou kopi mea o lo'o i totonu ole MIQE ile su'eina ole nucleic acid.
A tilotilo i lenei fomu, e le mafai ona e nofo i luga.O le fomu o se dogma.Ina ia avea oe ma se tamaititi aoga maualuga, e tatau ona e fesili pe aisea.O mea taua o lenei laulau o le: Tulile mama, amiosaʻo, tumau, ma le aofaʻi o le RNA .
O le vaega muamua o lefa'agasologa po'o meafaigāluega o le la'asaga o le su'eina o le nucleic acid.Afai e te fa'aogaina se su'ega nucleic acid otometi e su'e mai ai (fa'amolemole fa'afeso'ota'i a'u mo le fa'atau), e tatau ona e fa'ailoa le igoa fa'ata'ita'i o le meafaigāluega.
Le igoa o le pusa ma
o le a le pusa na faʻaaogaina mo faʻamatalaga suiga, o a mea faʻapitoa na faʻaopoopoina poʻo a faʻatinoga faʻapitoa na faia e tatau ona faʻamalamalama manino ina ia mafai e isi ona toe fai lau suʻega.
O nisi tagata e faʻaopoopoina ni mea faʻapitoa pe a suʻeina faʻataʻitaʻiga faʻapitoa, ma manatu o la latou auupega faalilolilo lea ma e le taʻuina atu i isi.A'o fa'alilolilo, latou te leiloa fo'i le avanoa e fa'amalamalama ai lau tala.Aua e te popoto, e tatau ona sili atu lou faamaoni nai lo le atunuu tuai o Zhang i suesuega faasaienitisi, afai e te manao e atamai, o le tala e faavalevalea ai.
e tatau ona manatua le numera o oloa o le pusape a e faʻatonu le pusa ma tusi le tusiga.E masani lava e lua numera i luga o le pusa: Cat—numera fa'amaumauga (numera o oloa, numera o tala), Lot—numera o fanua ( Fa'aaoga e ta'u mai ai po'o fea vaega na sau ai le oloa).
E le gata i lea, o le numera CAS e masani ona faʻaaogaina pe a faʻatonuina faʻamaʻi meaola, ma o le a ou faʻasalalau faʻatasi.O le numera CAS o le numera na tu'uina atu e le American Chemical Society i vaila'au fou ta'itasi.E masani lava, e tolu numera e fesoʻotaʻi i se vase.Numera CAS a Rushui: 7732-18-5.O vaila'au e masani ona tele igoa, ae o le numera CAS e tulaga ese.A oka vaila'au, e mafai ona e siaki muamua lana numera CAS.
E latalata i le aiga, aisea e tatau ai ona tatou faamatalaina manino nei mea?O le mea moni, e tatau foi ona siaki le tulaga lelei o le RNA.O le fa'aogaina o meafaifa'aili ma kits o le a fa'agasolo ai le fa'aogaina o le RNA.Ole fua ole su'ega ole falesu'esu'e masani e le tele, ma e mafai ona maua i pusa.
Faʻamatalaga o togafitiga DNase poʻo RNase
O le mataupu taua ole PCR fa'ata'ita'i fa'alelei ole puipuia ole fa'aleagaina ole DNA, ma 'aua le fa'ata'ita'i pe a iai se fa'ama'i.O le mea lea, e taua tele le taʻu atu o le faʻagasologa na e faʻaaogaina e faʻatautaia ai le DNA, ina ia faʻaalia ai o le DNA i le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga ua maeʻa ma aveese atoa.o lo'o fa'atusalia e se ata fa'ata'atia.
Ata fa'ata'atia o le RNA ma le DNA
I se tulaga lautele, o le auala mo le aveeseina o DNA o le togafitia o le RNA ma le DNase pe a uma ona aveese.Ae ui i lea, o auala tuai nei.O pusa fa'atauga RNA fa'apisinisi na mafai ona aveese DNA i le taimi o le fa'agasologa e aunoa ma le fa'aopoopoina o le DNase.Mo se faʻataʻitaʻiga, o se faasologa o pusa mai Foregene.
Manatua: O le aveeseina o le DNA i le taimi o le RNA o se pelu mata-lua mataʻutia, lea o le a faʻaumiina ai le taimi o le faʻaogaina o le RNA ma faʻateleina le lamatiaga o le faʻaleagaina o le RNA.O le mea moni, o se fefaʻatauaʻiga i le va o le RNA ma le mama.
E le gata i lea, o le aofaʻi o le DNase e faʻaopoopo i le koluma adsorption faʻavae silica e laʻititi lava, ma e tatau ona faʻaogaina le DNase maualuga e ausia ai le aʻafiaga.DNase unoptimized e le mafai ona digested vave ma atoatoa.Ole su'ega lea ole tulaga fa'atekinisi a le faioloa.O le mea moni, o loʻo i ai le tele o tagata faʻatau oloa e faʻamaualuga e mafai ona aveese le DNA e aunoa ma le DNase.E mafai ona fai mai o soʻo se tasi e faʻamaualuga e mafai ona aveese atoa le DNA e aunoa ma le DNase o se faʻatauvalea.O le DNA o se fausaga mautu e lua, ma e le mafai ona soloiesea i le na o le talanoa ma talie.
Iloiloga fa'aleagaina
metotia su'esu'e: su'esu'ega electrophoresis, 1% agarose, 6V/cm, 15min, uta 1-3 ul
Nucleic acid quantitative analysis
e masani ona fua i le fa'aogaina o le UV spectrophotometer.Sei ou faalauiloa muamua le uiga o tulaga taua e tolu o le OD260, OD280, ma le OD230.
·OD260nm: O le umi ole galu ole absorption pito sili ona maualuga ole absorption ole nucleic acid, ma o le tau sili ona fuaina mai le 0.1 i le 1.0.Afai e leai, fa'asusu pe fa'a'ono'o le fa'ata'ita'iga e aumai i totonu o le lautele.
·OD280nm: O le umi ole galu ole absorption ole pito maualuga ole absorption ole polotini ma mea phenolic.
·OD230nm: O le umi o le galu absorption o le maualuga maualuga absorption o carbohydrates.
Sosoo ai, tatou talanoa e uiga i le matafaioi o faailoga taitasi.Mo le A260, e mafai ona faʻaaogaina e fua ai le fua o le nucleic acid.A o OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.
Mo le mama, e tatau ona tatou vaʻavaʻai i fua faatatau e masani ona tatou vaʻaia: OD260/280 ma OD260/230.
· DNA mama: OD260/280 e tusa ma le 1.8.A sili atu nai lo le 1.9, o loʻo faʻaalia ai o loʻo i ai le faʻaleagaina o le RNA, ma a laʻititi ifo i le 1.6, e faʻaalia ai o loʻo i ai le polotini ma le phenol pollution.
· RNA mama: 1.7
·OD260/230: Pe o le DNA poʻo le RNA, o le faʻamatalaga o le 2.5.A itiiti ifo i le 2.0, e faʻaalia ai o loʻo i ai le filogia o le suka, masima ma mea faʻaola.
RNA fa'amaoni
E taua tele le fuaina o le faʻamaoni o le RNA.E masani lava, e mana'omia le faia o se su'ega RNA denaturation gel e siaki ai pe o le susulu i le va o le 28S ma le 18S RNA o se mafutaga fa'alua.A aliali mai le vaega lona tolu 5S, o lona uiga ua amata ona faʻaleagaina le RNA, sei vagana ai invertebrates.
Faʻamatalaga mo le iloiloga o le lelei o le RNA: I le faʻaopoopoga i suʻega o loʻo i luga, o loʻo i ai foi nisi o suʻega meafaigaluega sili atu i tulaga o le RNA faʻamaoni, e pei o le RQI integrity test o le Experion automatic electrophoresis system, lea e mafai ona iloa pe faʻaleagaina le RNA.
I su'esu'ega fa'asaienisi, o le PCR fa'ata'ita'i fa'amalama o se fa'atusatusaga i le va o le kenera fa'atatau ma le kenera fa'asino i totonu.O le mea lea, i le faʻagasologa o le faʻasaoina o faʻataʻitaʻiga RNA, RNA extraction, ma isi mea, o le sini autu o le faʻamautinoaina o le faʻamaoni o le RNA .
E fa'afefea ona a'afia e le fa'amaoni o le RNA le paleni i le va o le kenera fa'atatau ma le fa'asinomaga fa'alotoifale e mafai ona faigofie ona malamalama mai le ata o lo'o i lalo.O le faʻaleagaina o le a taʻitaʻia ai le le atoatoa o le kenera, pe o le le atoatoa o le kenera faasinomaga i totonu poʻo le le atoatoa o le kenera taulaʻi, o le a iai se aafiaga tele i faʻamaumauga.
Ata fa'ata'ita'i o le kenera fa'atatau ma le fa'asinomaga, e le tatau ona moni
Suʻega faʻalavelave (pe o le CT tau o loʻo taofiofia i lalo o le maualuga pe maualalo le faʻatonuga poʻo isi tulaga)
I le avea ai ma faʻataʻitaʻiga lenei, o le Ct faʻatatau o pupuni e lima e faʻapea.O le tufatufaina atu o tau o le CT i le va o pupuni e le tutusa, ma o le Ct o loʻo faʻatuai i lalo o le maualuga ma le maualalo, o le tulaga lea o le faʻalavelave PCR.
Manatu autu: I le faagasologa o le RNA extraction, tatou te manaʻomia le lafoai o manatu sese ma faʻavae saʻo.
O le manatu sese o le: RNA extraction na o le tuliloaina o fua, ma le manatu o le tele o le aofaʻi o le RNA e maua, o le sili atu lea.O le mea moni, pe a tatou faia le quantification, afai e le tele tele le numera o kene, tatou te le manaʻomia tele RNA.Ole aofa'i ole RNA e te su'eina e sili atu nai lo le lava.
O le manatu sa'o o le:O le fa'aaogaina o le RNA e tatau ona tulituliloa le mama, fa'amaoni ma le tumau.O le mama e mafai ona faʻamautinoa e le faʻalavelaveina le faʻaliliuga faʻasolosolo mulimuli ane ma o faʻamatalaga o le a le afaina i le DNA.O le fa'amaoni e fa'amautinoa ai le paleni o fa'asologa fa'atatau ma fa'asinomaga i totonu.O le ogatasi e mautinoa le mautu o le utaina o faataitaiga.
MIQE (4) – fa'aliliu fa'aliliu
Le manatu sese: o le tulituliloaina o le maualuga o le volume faataitai.
Sa'o manatu: Saili le faʻamaoni (mautu), e tusa lava po o le a le aofaʻi o le RNA o loʻo faʻapipiʻiina, o le lelei o le faʻaliliuga faʻasolosolo e tumau pea, faʻamautinoa o eseesega i le cDNA e mafai ona atagia moni ai eseesega i le mRNA.
Matou te faʻamatalaina lenei faʻagasologa i se faʻataʻitaʻiga ata:
Ata fa'ata'ita'i o fa'aliliuga fa'aliliuga lelei, e le sa'o
Muamua lava, e tatau ona tatou malamalama i le eseesega i le va o le faʻaliliuga faʻasologa o le faʻasologa ma le PCR.O le PCR e faia le tele o fa'avevela ma fa'agasolo, ma fa'atupula'ia le vaega fa'atatau;a'o fa'aliliu'ese fa'aliliuga e leai se fa'agasologa lea, e mafai ona tatou fa'apea o le fa'aliliuga fa'aliliu e moni lava tasi-i-tasi I le faagasologa o le toe faia, e pei o le tele o fasi RNA.
ona o loʻo i ai e mafai ona maua le tele o faʻamatalaga o le cDNA, e tatau ona malamalama i le taimi nei, aua o vaega tetele ma laiti ua toe faʻaliliu, ma e le mafai ona taulaʻi i le tasi vaega.Ma talu ai ona o le aofaʻi o le RNA e laʻititi, o le aofaʻi o le cDNA e maua e laʻititi foi, e le pei o le PCR, lea e i ai le faʻaopoopoga o le aafiaga, o lea e matuaʻi le mafai ona iloa.
cDNA electrophoresis taunuuga
Lona lua, o le mea sili, o le faʻaliliuina o tusitusiga e faia tasi i le tasi, ae leai se faʻaliliuga faʻaliliu mai soʻo se kamupani e mafai ona ausia lenei aafiaga.O le mea moni, o le lelei o le tele o faʻaliliuga faʻaliliu e feoai i le va o le 30-50%.Afai o le tulaga lea, e sili atu ona mautu le lelei o tusitusiga, o le mea lea tatou te fia vaʻai i ai i le ata: 3 RNA maua 2 cDNA, 6 RNA maua 4 cDNA, e tusa lava po o le a le tele o faʻataʻitaʻiga o loʻo utaina, o le faʻaliliuga faʻaliliuga lelei e matua mautu.Matou te le manaʻo e vaʻai i le tulaga e le mautu ai le lelei o le faʻaliliuga ma faʻalavelave maualuga.
E fa'afefea la ona fa'amaonia pe mautu le fa'aliliuga fa'aliliuga lelei?O le auala e matua faigofie lava, e tatau ona e faia se suʻega faʻatusatusaga: o le tasi o le faʻaliliuina o le transcribe i le cDNA pe a uma ona faʻaluaina le faʻafefeteina o le RNA, ma le isi o le faia lea o le faʻaluaina o le faʻafefeteina pe a uma ona toe faʻaliliuina i le cDNA, ona fai lea o le qPCR e vaʻai ai i le faʻaogaina o le slope.I le avea ai ma se tamaititi aoga maualuga, e tatau ona e malamalama i ai i sekone.E pei ona fa'aalia i lalo:
Fa'aliga ole RNA ma le cDNA e su'e ai pe mautu le lelei ole fa'aliliuga fa'aliliu
Reverse transcriptase ma pusa
E fa'afefea ona maua e le PCR fa'ata'ita'i fa'alelei atoatoa lelei le fa'aliliuina ma le pusa.O le Reverse transcriptase e vaevaeina i ni ituaiga se lua e tusa ai ma le puna, AMV poʻoM-MLV, ma o latou faʻatinoga e tutusa ma le faʻaalia i le laulau.
RNase H gaoioiga
RNase H o le Ribonuclease H, o le igoa Saina o le ribonuclease H, o se endoribonuclease lea e mafai ona faʻapipiʻi faapitoa le RNA i le DNA-RNA hybrid chain.E le mafai e le RNase H ona fa'afefeteina fa'amauga phosphodiester i le DNA po'o le DNA po'o le RNA, o lona uiga, e le mafai ona eliina le DNA po'o le RNA.E masani ona fa'aaogaina i le fa'asologa o le laina lona lua o le cDNA.
Ose mea uiga ese.Matou te fai atu o le reverse transcriptase o loʻo i ai le RNase H, ae le o le reverse transcriptase o loʻo i ai le RNase H, ma atonu e le mafai ona vavae ese le RNase H mai le faʻaliliuina o le transcriptase, masalo ona o le faʻaogaina o nisi vaega i le faʻasologa o le transcriptase O lenei gaioiga e mafua mai i le reverse transcriptase.
O le mea lea, e tusa lava po o le a le maualuga o le faʻaliliuina o le AMV, o lana RNase H gaioiga e faʻaitiitia ai le gaosiga o le cDNA.O le mea moni, o loʻo faʻaleleia pea e le au gaosi oloa a latou oloa e faʻaumatia ai le RNase H i le faʻaliliuina o le transcriptase i le tele e mafai ai e faʻateleina ai le gaosiga o le cDNA.
vevela vevela
Faiga lua ole RNA ile vevela eseese
Va'ai le ata o lo'o i luga mo le fausaga lona lua o le RNA i vevela eseese, ma fa'aoga le meafaigaluega i luga ole laiga mFold e fa'amautu ai le fausaga lona lua o le vaega fa'atatau i lalo o tulaga fa'apitoa o le vevela ma le masima.I le 55 ° C, o le fausaga lona lua o le RNA e matua faigata lava, e le mafai ona galue le transcriptase, ma e le mafai ona foia atoatoa le fausaga lona lua seia oo i le 65 ° C, ae o le maualuga o le vevela o le AMV ma le M-MLV e maualalo ifo nai lo lenei vevela.
o le a le mea e fai?O le fausaga lona lua o le fetaui lelei lea o le mamanu lava ia, lea e taitai atu ai i le tauvaga malosi i le va o le primer ma le reverse transcriptase ma le mamanu, e mafua ai le tele o faafitauli e pei o le maualalo o le E ma le le lelei o le toe faia.
o le a le mea e fai?Na'o le fa'atuputeleina o le vevela fa'afefe i le tele e mafai ai.
O le tele o kamupani gaosi mea e faʻaleleia ai a latou faʻaliliuga faʻasolosolo e ala i le inisinia faʻainisinia.O nisi e faateleina le vevela o le tali, e pei o Jifan ma Aidelai, ma o nisi e aveese le vaega malosi o le RNase H enzyme e faaleleia atili ai le sootaga i le va o le enzyme ma le RNA template.E mafai ona fa'atauva'a fa'atauva le fa'atulagaina lona lua ma faitau sologa lelei, ma fa'aleleia atili ai le lelei o le fa'aliliuga fa'aliliu.
Manatu autu: Fa'aliliuga fa'aliliuga e sili atu ona taua le tulituliloaina o le fa'asolosolo lelei o le fa'aliliuina o le fa'aliliuga (enzymes e le gata e tatau ona lelei ae ia mautu), nai lo le aofa'i o fa'ata'ita'iga utaina, pe afai e le o se PCR fa'asili-tele-tele fa'atele, o le a le mafai lava.Tele cDNAs.
Ua faia foi e le au gaosi eseese ni taumafaiga i le sailiga o le tumau.Mo se faʻataʻitaʻiga, o le tele o kamupani ua faʻapipiʻiina nei faʻaliliuga faʻaliliu e avea o se pusa masani mo le faʻatau, o se filifiliga lelei.
Mo se faʻataʻitaʻiga, Foregene's RT Easy Series kits:
RT Easy I (Master premix mo le vaega muamua cDNA synthesis kit)
MIQE (5) – fa'amatalaga o kenera fa'atatau
O loʻo faʻamatalaina e le ata o loʻo i luga
1. Pe o lelei lenei kenera mo su'esu'ega faifaipea e mafai ona fa'amaonia i su'esu'ega faifaipea.
2. Gene ID, e te iloa.
3. O le umi o le kene, o le aofaʻi atoa o le kenera taulaʻi e mautinoa lava e leai se faʻafitauli.Pe a mamanuina primers, ia mautinoa o le umi o le amplicon o loʻo i le va o le 80-200bp e faʻamautinoa ai le sili atu le faʻaleleia atili.
4. Fa'amatalaga Fa'atusatusaga Fa'asologa, e mana'omia le fa'atusatusaina o le kenera fa'atatau i le genebank e puipuia ai le fa'atuputeleina e le fa'apitoa.
5. Le i ai o pseudogenes.O le pseudogene o se DNA fa'asologa e tutusa ma se gene masani ae leiloa lana galuega masani.E masani ona i ai i le tele-gene aiga o eukaryotes.E masani ona fa'atusaina e le ψ.O se kopi DNA genomic e le o galue i totonu o le genome e tutusa lelei ma le fa'asologa o gene coding., e masani lava e le o tusia, ma e leai se uiga manino o le physiological.
6. Tulaga o mea muamua e fa'atatau i exons ma introns.I uluai tausaga, ina ua matou foia le faafitauli o le faaleagaina o DNA, e masani ona matou gauai atu i tulaga o primers, exons, ma introns, ma e masani ona mafaufau i le mamanuina o primers i totonu o introns e aloese ai mai le faʻalauteleina o DNA.Fa'amolemole taga'i i le ata o lo'o i lalo: o le uliuli o lo'o fa'atusalia i totonu, lanu moana eseese o lo'o fa'atusalia ai mea fa'apitoa, piniki o lo'o fa'atusalia ai mea masani, ma mumu pupula o lo'o fa'atusalia i totonu-spanning primers.
Fuafuaga, e le sa'o
Oka se fuafuaga atoatoa e foliga mai, ae o le mea moni, i le tele o tulaga, o le trans-intron primers e le o se mea faʻapitoa e pei ona mafaufauina, ma o le a mafua ai foi le faʻalauteleina o le le faʻapitoa.O le auala sili la e puipuia ai le faaleagaina o le DNA o le aveese atoa lea o le DNA.
7. Va'aiga fa'atusa.I le toe faʻaaogaina o lenei faʻataʻitaʻiga, faʻaaoga le mFold i luga ole laiga meafaigaluega e fuafua ai le fausaga lona lua o le vaega faʻatatau ile vevela maʻi masima.
Faiga lua ole RNA ile vevela eseese
O le fausaga lona lua o le fetaui lelei o le mamanu lava ia, lea o le a taʻitaʻia ai le tauvaga malosi i le va o le faʻapipiʻi muamua ma le faʻataʻitaʻiga, ma o avanoa e faʻapipiʻi muamua ai e itiiti, e mafua ai le tele o faʻafitauli e pei o le maualalo o le E ma le le lelei le toe faʻaleleia.E ala i faʻamatalaga faʻapipiʻi, afai e leai se faʻafitauli lona lua, e lelei tele.Afai e iai, o le a talanoaina faʻapitoa la matou tusiga tulitatao pe faʻafefea ona foia lenei faʻafitauli.
MIQE (6)—qPCR Oligonucleotides
Mo PCR fluorescent quantitative, o le mea muamua e te tauivi ma aso uma o le RNA extraction, ma o le mea lona lua atonu o le mamanu muamua.
Muamua lava, matou te siakiina pea tulafono e uiga i le mamanu muamua e tusa ai ma le lisi siaki a le MIQE.E matua faigofie lava e mafai ona talie le au ulavale, ma e mafai ona tatou faʻamaeʻaina i se fuaiupu e tasi: suʻe le faʻasologa ma le tulaga o le suʻega muamua ma le auala faʻaleleia.Mo le auala faʻamamāina muamua, faʻapipiʻi muamua e matua taugofie i le taimi nei, e agavaa le qPCR ile ITULAU ma luga ole auala faʻamamaina, ma e le taua le faʻamatalaga o le meafaigaluega faʻapipiʻi.O le toʻatele o tagata o loʻo faia faʻamatalaga mo le tele o tausaga ma latou te le iloa o le synthesizer o le ABI3900.
E tusa ai ma mataupu faavae o le mamanu muamua, e te le tau taulotoina e ala i le taulotoina, aua o le tele o polokalama faakomepiuta muamua po o meafaigaluega i luga ole laiga e mafai ona taulimaina nei faafitauli (fautuaina meafaigaluega i luga ole laiga primer3.ut.ee/), ma le 99.999% o le mamanu muamua e le faia ma le lima Vaʻai, o nisi taimi e mamanuina ai e le tusitala le faitau selau o primers i le aso, afai e te faitau taʻitasi, o le a avea ma mata feʻai.
Na'o le siaki o mea nei pe a uma ona fa'atulaga mea muamua:
1. Fuafuaga muamua e latalata i le 3' fa'ai'uga: I le tulaga o le fa'aogaina o le oligo dT primers mo le cDNA first-strand synthesis, mafaufau i le fa'aliliuina o le fa'aliliuga lelei ma le RNA fa'amaoni, e mana'omia le fa'ata'ita'iina o mea fa'apolopolo e latalata i le fa'ai'uga 3' e fa'aleleia atili ai le fa'aleleia atili.Fa'aoga se ata e fa'amatala ai fa'apea (e leai se auala e malamalama ai i lenei mea):
Aisea e tatau ai ona mamanuina fa'auluuluga e latalata ile pito 3′, e le tatau ona moni
2. TM tau: O le tau Tm o loʻo i le 55-65 ° C (ona o le gaioiga o le exonuclease e sili ona maualuga i le 60 ° C), ma le GC o loʻo i le 40% -60%.
3. BLAST: Ina ia aloese mai le faʻalauteleina le faʻapitoa o le genome, e tatau ona faʻaogaina le Blast mo faʻamaoniga faaopoopo.
MIQE(7)—qPCR faiga
1. pusa qPCR
E tusa ai ma manaʻoga o le MIQE, e tatau ona tatou faʻamatalaina manino le tulaga o tali i totonu o le tusiga, e aofia ai le faʻatulagaina o le PCR reaction system, o le a le pusa e faʻaaogaina, o ai le gaosiga, pe o le a le tele o le tali, pe faʻaaogaina le auala vali poʻo le suʻesuʻega, PCR polokalame faʻatulagaina.O aveta'avale tuai o le a mautinoa lava pe a filifilia le pusa, o fa'amatalaga o lo'o i luga o lo'o fa'amoemoeina.
I le taimi nei, o le gaosiga ma le gaosiga o pusa PCR fa'aluulu o se tekonolosi matua.Afai lava e te le filifilia ni gaosiga leaga tele, e le maualuga le avanoa o faʻafitauli, ae matou te manaʻo e faʻasoa atu ia te oe ni nai manatu:
Taq enzyme amata vevela:O le vaega pito sili ona taua o le PCR o le vevela-amata Taq enzyme.O enzymes amata vevela i luga o le maketi e masani ona vaevaeina i ni ituaiga se lua, o le tasi o se vailaʻau vevela vevela (e mafai ona e mafaufauina o le paraffin embedding), ma le isi O se enzyme vevela-amata mo le suiga o le antibody (antigen-antibody binding).Ole suiga ole vaila'au ose auala vave ole vevela-amata ole enzymes.A oʻo i se vevela faʻapitoa, o le enzyme o le a faʻamalolo lana gaioiga.E fa'aogaina e le antibody-modified hot-start enzyme auala fa'aola e poloka ai le gaioiga a le enzyme.A oʻo i se vevela faʻapitoa, o le antibody o le a denatured ma le faʻaaogaina e avea o se polotini, ma o le a faʻaalia le gaioiga o le enzyme.
Ae ui i lea, o le a le aoga o lenei mea?O le tulaga lea, o le faʻamalologa o enzymes ua faʻaleleia e le antibody e sili atu le vave nai lo le faʻaogaina o enzymes, e tusa ai ma le maʻaleʻale, o enzymes e faʻaleleia ai le antibody e i ai sina avanoa, ina ia leai ni enzymes faʻaleleia faʻamaʻi i totonu o pusa i luga o le maketi.Afai ei ai, o loʻo tumau pea le tekonolosi a lenei gaosiga i le vaitau o le meleniuma.
Fa'atonuga o le magnesium ion:O le fa'aogaina o le magnesium ion e taua tele i le tali PCR.Ole fa'aogaina ole magnesium talafeagai e mafai ona fa'aolaina ai le fa'asa'olotoina ole gaioiga ole enzyme Taq.Afai e maualalo tele le faʻatonuga, o le gaioiga o le enzyme o le a faʻaitiitia tele;afai e maualuga tele le faʻatonuga, o le enzyme-catalyzed non-specific amplification o le a faʻaleleia.O le faʻaogaina o ion magnesium o le a aʻafia ai foʻi le faʻapipiʻiina o mea muamua, le vevela o le faʻataʻitaʻiga ma oloa PCR, ma faʻapea ona aʻafia ai le gaosiga o vaega faʻateleina.O le faʻatonuga o ion magnesium e masani ona pulea ile 25mM.Ioe, mo se pusa lelei, e tatau ona pulea lelei le faʻaogaina o ion magnesium.O nisi tagata faʻatau oloa faʻaopoopoina se sui o le magnesium ion chelating agent i le reagent, lea e mafai ona ausia le aʻafiaga o le fetuunaiga otometi o le faʻaogaina o le magnesium ion.
Fugala'au fa'a'ai ole fa'a'au'au:O le lanu felanulanua'i, o le SYBR Green lea e masani ona tatou fa'aogaina, e tele lava ina fa'atupuina le fa'amumū e ala i le pipii atu i le tootoo la'ititi o le DNA fa'alua, ona o le fusifusia o le vali i le DNA fa'alua e le fa'apitoa, o lona uiga A tu'u fa'atasi le DNA fa'alua fa'atasi ma ia, e mafai ona tupu le fa'amalama i totonu o le DNA ma fa'apipi'iina ai se fa'ailoga DNA, ona fa'atupu ai lea o se fa'ailoga DNA, ma fa'apipi'i ai le fa'amalama o le DNA.
PS: Ona o le malamalama-maaleale meatotino, oloa i luga o le maketi e masani ona afifiina i enaena opaque centrifuge tubes (e pei ona faaalia i le ata i lalo).Ae ui i lea, o lenei mea o le a feagai ma se faʻafitauli.E faigata ona va'ai pe susu le vai pe a fa'ata'ita'i.I lenei tulaga, o Qingke e moni lava e sili ona faʻaoga-faʻaoga (e pei ona faʻaalia i le ata o loʻo i lalo), ma o le faʻamalama manino o loʻo afifiina i totonu o se taga apa.Ona tuu lea i totonu o se taga apa, ma mafaufau i le faigofie o le aloese mai le malamalama ma le sampling.E tatau ona e filifilia le numera o oloa sa'o.O le TSE204 o se olaga e sili ona taugata, lea e mafua ai ona ou manaʻo e totō le mutia.
E taua tele fo'i le fa'aogaina o le lanu felanulanua'i.Afai e maualalo tele le faʻatonuga, o le a le alu aʻe le faʻapipiʻi faʻapipiʻi i le tulaga mulimuli ma e le atoatoa;afai e maualuga tele le faʻatonuga, o le a mafua ai le faʻalavelave leo.Talu ai e fa'alagolago tele le PCR fa'atatau i le tau o le CT, pe a le fa'asa'o lelei le fa'atonuga o le lanu felanulanua'i, e sili atu le pito maualalo nai lo le maualuga.O le mea moni, o le fa'aogaina o le vali talafeagai e sili ona lelei.
ROX: O vali ROX e fa'aoga e fa'asa'o ai fa'ailoga fa'alelei lelei-i-lelei.E mana'omia e nisi tagata gaosi meafaigāluega le fa'avasegaina, a'o isi e leai.Mo se faʻataʻitaʻiga, o le faʻaogaina o le Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR amplification instrument e masani ona manaʻomia le faʻavasegaina, e aofia ai le 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, ma isi. O faʻatonuga o pusa lautele o le a faʻamatalaina.
O le Foregene's qPCR Mix e iai foʻi le vali ROX, lea e faigofie mo le faʻaogaina i faʻataʻitaʻiga eseese.
Togafitiga vaivai o le hydrogen: O le togafitia o fusi faʻamaʻi vaivai o se mataupu faʻapitoa.E leai se mea na faitau i tusi lesona o le tele o pusa, ae leai se tasi oi latou na taʻua lenei autu.O le mea moni, e matua taua tele.O le tu'ufa'atasiga o fa'avae e fa'alagolago tele i le malosi o fa'amauga o le hydrogen.Ole malosi ole hydrogen o le fa'ateleina masani, ma le vaivai o le hydrogen e ta'ita'i atu ai i le fa'ateleina e le fa'apitoa.Afai e le mafai ona fa'amuta lelei fa'amauga o le hydrogen, e le mafai ona 'alofia le fa'ateleina o mea fa'apitoa.I totonu o le lautele o le tusitala, e na o ni nai kamupani na matauina lenei faafitauli.A e fa'atau le pusa, e mafai ona e va'ai pe ua e mafaufau i se fofo i lea tulaga mo le pusa e te mana'o e filifili.
Tele tali: O le 20-50ul system e masani ona faʻaaogaina, ma o voluma laiti e ono mafua ai mea sese.I le tulaga masani, o faʻatonuga o pusa o le a fautuaina le faʻaogaina o le PCR volumes tali.Aua le atamai ma fa'aaoga tusi laiti e sefe ai tau.le sini o.O le voluma fautuaina e le aufaioloa ua uma ona tofotofoina, ma atonu e le mafai ona latou foia le faafitauli o mea sese e mafua mai i voluma laiti.
2. Le gaosiga ma le tusiga numera o le ipu ipu
E iloa e tagata uma le mataupu faavae o le fluorescent quantitative PCR.O le aoina o le fluorescence e masani lava ona faia e ala ile PCR pu'upu'u.Pe a filifilia PCR consumables, fa'alogo lelei i itu e lua: lelei le felauaiga malamalama ma talafeagai mo le meafaigaluega.I se tulaga lautele, o laupapa ma paipa o ituaiga autu e lelei, ae e tatau ona e filifili ma le faaeteete i tulaga o fetuunaiga, a leai o le a le mafai ona e faʻaogaina le meafaigaluega.
4. Tulaga maualuga le malamalama
MIQE (8)—QPCR fa'amaonia
Ole fa'amuamua sili lea ole qPCR!E toatele naua toa ua pauu i le oneone iinei.Ioe, e mafai foi ona e laki ma e faigofie genes na e suʻesuʻeina, o lea na e faʻafefe ai i le ana aisa i le matagi.O faʻamatalaga faʻamaonia o le qPCR ua faʻamoemoe e suʻe le faʻamaoni o faʻamatalaga.Matou te lisiina faʻamatalaga faʻamaonia talafeagai e pei ona taua i lalo:
1. Su'ega fa'apitoa
O le faʻapitoa o le faʻalauteleina o le faʻauluina o le kenera e suʻeina e ala i le siakiina pe o le ata electrophoresis o se fusi e tasi;fa'asologa fa'asologa;liusuavai pi'o e iloa ai pe tasi le faafanua pito i luga;fa'amaoniga ole fa'aluina ole enzyme ma isi auala.
O iinei, tatou te taulai atu i le to le au'ili'iliga o le fa'alauteleina e le fa'apitoa e fa'aaoga ai le auala e fa'afefeteina ai pupuni.I se tulaga lautele, pe a tatou mamanuina primers, o le tele o le vaega o oloa e manaʻomia i le va o le 80-200bp, lea e faʻafefe ai le vevela o le PCR oloa 80-85 °C.O le mea lea, afai ei ai ni tumutumu eseese, e tatau ona i ai isi oloa faʻalauteleina e le faʻapitoa;afai e aliali mai le tumutumu i lalo ole 80°C, e masani lava ona manatu o se dimer muamua;afai e aliali mai le tumutumu i luga aʻe o le 85°C, e masani ona manatu o le DNA contamination poʻo le sili atu Nonspecific amplification o vaega tetele.
Manatua: O nisi taimi e tasi lava le tumutumu i le 80°C.I le taimi nei, e tatau ona tausisia lenei manatu.E foliga mai o fa'ai'uga o le fa'ateleina o dimer muamua uma.
Pi'o fa'afefete masani (tulaga tasi e leai se fa'aopoopoga fa'apitoa)
Fa'afitauli fa'afefete fa'afefeteina (fa'aliga fa'apitoa o tumutumu pepelo)
【Matā'upu su'esu'e】
O lo'o i ai se tumutumu autu, ae o le dimer muamua e ogaoga
O le faʻafefete faʻafefete tasi-peak i le ata o loʻo i lalo e mafai ona faigofie ona faʻasese ou mata, ma manatu o se faʻataʻitaʻiga atoatoa, ae o le taunuuga e matua sese.I le taimi nei, e tatau ona tatou vaʻavaʻai i le vevela o le liusuavai.O le maualuga o le vevela o loʻo i lalo ole 80°C, lea e matuaʻi-dimer atoa.
Leai se vaega o lo'o taula'i i ai, o dimer muamua uma
O iinei, e le mafai e lo'u uso ona taofi.O le ata o loʻo i lalo o se ata na puʻeina i se telefoni feaveaʻi na lafo mai ia te aʻu e se tagata ulavale.O reagents na ia faʻaaogaina o faʻailoga masani uma e faʻaaogaina i le alamanuia.Na ia suia mai le tasi T-prefix brand i le isi T-prefix brand.Ou te manatu ua uma ona e mateina.Na alaga mai le tagata ulavale ia te au: “O le vailaau o loo faaaogaina i le ata muamua e lelei tele, ma o le tumutumu e tasi.Mulimuli ane, pe a uma ona faʻaaogaina le reagent na e fautuaina, e pei o le ata lona lua, faʻatasi ai ma tumutumu fefiloi.Ua e faatiga ia te au.“
Vaevae ia kalafi e lua.I le tepa muamua, o le tasi e tasi le tumutumu, ae o le isi e faaluaina le tumutumu.E le aoga, e tasi le tumutumu e lelei.Pe moni lena mea?
E sili atu le leaga nai lo Dou E, afai ou te tuʻuina ata e lua i le ata o loʻo i lalo, o le ae malamalama vave.O le mea moni, e faigofie ona tatou pipili i lenei ituaiga o ata.Ina ua mae'a su'esu'ega ma le toto'a, na matou iloa ai: o le pito i luga o le ata muamua o lo'o i le 75°C, o le dimer muamua;o le tumutumu o le ata lona lua o loʻo faʻaalia i le 75 ° C ma le 82 ° C, a itiiti ifo o loʻo i ai O le oloa e aliali mai.
Ata o manatu faaalia mai tamaiti aoga
O le faafitauli autu e le o le faafitauli o reagents, ae o le faafitauli o le mamanu muamua.I le taimi lava e tasi, e faʻamaonia ai foi o nisi o ituaiga tetele e le o ni uʻamea, ma faʻamaonia ai foi le mea na fai mai ai loʻu tuagane muamua: E le o le reagent brand e lagolagoina lau tusiga.O lau tusiga na faʻapipiʻiina le ituaiga o reagents.Vaai faalemafaufau, afai e le suia e le scumbag ia reagents, o faʻamatalaga sese o le a lafoina i le tusi talaaga, ma o le a le mea e tupu o se faʻalavelave.
2. Ct tau ole pule avanoa
Aua le faʻamatalaina, afai o le faʻatonuga avanoa e iai se Ct tau, e le o le filogia?Ae ui i lea, e manaʻomia pea ona e malamalama po o le fea pule avanoa e iai le tau Ct.Afai o le NTC, o lona uiga o loʻo i ai le DNA mai fafo e pei o le faʻaleagaina o le reagent.Afai o le NRT, o lona uiga o le RNA na maua mai e iai le faʻaleagaina o DNA.
3. Pipi masani
Fa'atasi ai ma le fa'asolosolo ma le fua fa'atatau, e mafai ona fa'atatau le lelei o le PCR e ala i le fua fa'atatau.O se fa'ata'ita'iga atoatoa e mana'omia ai le slope o le pi'o masani e fa'alatalata atu i le 3.32, ma le R² e fa'alatalata atu i le 0.9999.
4. Linear dynamic range
Ole fa'agaio'iga ole fa'agaioiga ole laina.E tusa ai ma le faʻataʻitaʻiga o loʻo faʻaaogaina e faʻatupu ai le faʻasologa masani, e tatau ona aofia ai le le itiiti ifo i le 5 gradients faʻatonuga, ma faʻalogo i le suiga o tau Ct i gradients maualuga maualuga ma le maualalo o le faʻaogaina.
5. Sa'o le su'esu'eina
Suiga i taunuuga o le qPCR, o lona uiga, le lelei le toe faia, o lona uiga, le lelei le saʻo, e mafua mai i le tele o mea, e aofia ai le vevela, faʻatonuga, ma le gaioiga.O le sa'o o le qPCR e masani lava ona fa'aitiitia le fa'atonuina pe a fa'aitiitia numera kopi.E sili ona lelei i totonu-fa'ata'ita'iga fesuiaiga, o lenei fesuiaiga fa'apitoa e tatau ona 'ese'ese mai suiga fa'ale-ola, ma fa'ata'ita'iga fa'aola e mafai ona fa'afeso'ota'i sa'o ese'esega fa'afuainumera i taunu'uga qPCR i le va o vaega po'o togafitiga.Aemaise mo su'esu'ega fa'ata'ita'iga, e tatau ona lipotia le sa'o lelei o le va'aiga fa'atasi (toe fa'afouina) i nofoaga ma fa'alapotopotoga.
6. Su'esu'e lelei ma LOD (i multiplex qPCR)
LOD o le fa'amaualalo aupito maualalo o le 95% o fa'ata'ita'iga lelei na maua.I se isi faaupuga, o le faʻatonuga o le LOD o loʻo i totonu o se seti o faʻasologa o kenera faʻatatau e le tatau ona sili atu i le 5% o tali le manuia.Pe a faia le multiplex qPCR auʻiliʻiliga, aemaise lava mo le suʻesuʻeina faʻatasi o suiga mataʻutia poʻo polymorphisms, e manaʻomia e le multiplex qPCR ona tuʻuina atu faʻamaoniga e le faʻafefeteina le saʻo o le tele o vaega o loʻo taulaʻi i totonu o le paipa lava e tasi, e tele suʻesuʻega ma faʻamaʻi faʻapipiʻi tasi E tatau ona tutusa lelei ma LOD.Aemaise lava pe a fa'atuputeleina i le taimi e tasi genes fa'atatau maualuga ma kene fa'amaumau, e tatau ona fa'alogo lelei i lenei fa'afitauli.
Faafitauli ma fofoI se tulaga lautele, o faʻafitauli e masani ona feagai i le qPCR debugging e taulaʻi i vaega nei:
· fa'ateleina fa'apitoa
· Faigata filifiliga o le fa'atonuga muamua ma fa'alavelave fa'atasi ma primer-dimers
· E le sa'o le vevela o le fa'agata
· O le fausaga lona lua e a'afia ai le fa'atuputeleina lelei
fa'aliga lē fa'apitoa
fa'aliga lē fa'apitoatupu , e masani lava ona manatu pe le talafeagai le mamanu muamua, ae afai e te le o faanatinati e sui le primers, e mafai ona e faʻataʻitaʻi muamua auala nei (o loʻo faʻapipiʻi foi le mataupu faavae):
· Fa'ateleina le vevela o le fa'ama'i - taumafai e fai fa'agata vaivai o le hydrogen e le mafai ona fa'atumauina;
· Fa'apu'upu'u taimi fa'a'ele'ele ma fa'aumiumi - fa'aitiitia le avanoa e vaivai ai so'oga hydrogen;
· Faʻaitiitia le faʻaogaina muamua - faʻaitiitia le avanoa e fusifusia ai faʻamaʻi faʻasolosolo ma vaega e le o faʻatatauina;
Maualalo le fa'atuputeleina lelei
O le tulaga faafeagai i le faʻalauteleina le faʻapitoa - maualalo le lelei o le faʻaleleia, ma faiga e faʻatautaia ai le maualalo o le faʻaleleia lelei o le faʻafeagai:
· Fa'aumi le taimi fa'atosina ma fa'aumi;
· Suia i le PCR tolu-laasaga ma faʻaitiitia le vevela faʻafefe;
· Faʻateleina le faʻaogaina muamua;
Ps: O le toʻatele o tamaiti aʻoga faʻauʻu na fananau mai i le 90s e le o naunau e suʻesuʻe pe faʻafefea ona faʻataʻitaʻiina faʻataʻitaʻiga, ma faʻamoemoe e mafai e le pusa ona foia atoatoa le faʻafitauli (pe afai e te manaʻo e alu i se kamupani reagent e fai suʻesuʻega ma atinaʻe pe a maeʻa le faʻauʻuga), o le mea moni, e manatu foi le au gaosi oloa i lenei auala, ou te faʻamoemoe o se valea E mafai ona faʻaaogaina pe a e mauaina, o lea e aofia ai le tele o le faʻafitauli o le gaosiga o le gaosiga, e aofia ai le tele o faʻafitauli o le faʻaogaina o le gaosiga, e aofia ai le tele o faʻafitauli o le faʻaogaina o le gaosiga. vaivai H- fusifusia mea taua.Ina ia faigofie ona foia le faafitauli, e tatau lava i tagata valea ona faitau i le folasaga a le kamupani reagent e iloa ai pe i ai se mea e mitiia ai sootaga vaivai o le hydrogen.
Faigata le filifiliga o le fa'atonuga muamua ma fa'alavelave fa'atasi ma primer-dimer
Metotia 1: I le tulaga masani, o fa'atonuga o pusa mo le qPCR o lo'o fautuaina ai faiga ma fa'atonuga fa'amuamua.
Metotia 2: Debugging e ala i le setiina o le gradient fa'amatamata.O le ata o loʻo i lalo ua gaoia mai se kamupani e faʻaalia.O le ata o lo'o i lalo o lo'o fa'aalia ai fa'ai'uga fa'afuainumera fa'amumū na faia i fa'ama'i fa'ato'a muamua e tolu (100nM, 250nM, 500nM) ma fa'ata'ita'iga fa'avasegaga fa'atonu (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).O le tau Ct o fa'ai'uga fa'ata'ita'iga o lo'o fa'atulagaina e fa'apea:
Filifiliga Fa'atosina Fa'atasi Fa'atasi fa'atonuga muamua i se laina fa'apea:
O le filifiliga o le fa'atonuga muamua e manino lava, o le feso'ota'iga laina o le fa'atonuga muamua o le 100nM ma le 250nM e sili atu, ma o le feso'ota'iga laina o le fa'atonuga muamua o le 500nM e matua leaga lava.I le 100nM ma le 250nM, o le tau Ct o le 250nM e laʻititi laʻititi, o le mea sili ona lelei le faʻaogaina o le 250nM.E masani lava ona mata'utia primer-dimer e mafai ona vaaia i le pi'o liusuavai.Ae fa'afefea pe a le mafai e mea fa'avae ua fuafuaina ona 'alo'ese mai fa'amalama-dimer?
Metotia 3: Faʻaitiʻitia le aofaʻi o mea muamua ma faʻateleina le vevela faʻafefe (leai se manaʻoga e faʻamatalaina).
O le tau faʻapitoa o le vevela faʻafefe e 60°C.Afai e te le o mautinoa, faʻafefea ona filifili se vevela faʻafefete sili atu ona talafeagai?O le tali e tutusa ma le filifiliga o le fa'atonuga muamua -su'ega fa'alelei.Ave se ata mai le kamupani Bio-rad e faʻaalia ai le faʻafitauli.Mo le faʻalauteleina o se vaega faʻapitoa, seti valu gradients vevela, taʻitasi ma le tolu toe fai, ma o le faʻaogaina o le faʻaopoopoga o loʻo faʻapea:
filifilia o le vevela fa'anene:
· 70°C, 69°C—O le mea moni, e le mafai ona tuʻufaʻatasia faʻamuamua, o lea e leai se faʻaopoopoga.
· 67.3 ° C - O loʻo i ai se vaega itiiti o le faʻalauteleina i le amataga, ma o le tau Ct e fai si tele.
·64.5°C——Ua faaitiitia le tau o le Ct.
· I le 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, ma le 55.0°C, o le tau o le Ct e masani lava ona mautu, ae o le tau fluorescence mulimuli e eseese.
E faapefea ona filifili?Mataupu Faavae: O le mataupu faavae muamua o le maualuga Ct tau.Mo le tau tutusa Ct, filifili se vevela faʻafefe maualuga e aloese ai mai le dimerization ma le faʻalauteleina e le faʻapitoa.E ui lava o loʻo i ai se maualuga maualuga o le fluorescence i le 55 ° C, atonu o loʻo i ai ni dimers poʻo se faʻalauteleina e le faʻapitoa i totonu.
Ae afai e te atamai e pei o oe, o le a mautinoa lava e te mafaufau: I le tautala saʻo, afai o le tali a le PCR e matua faʻapitoa, pe a sili atu le faʻatonuga muamua i le mea e manaʻomia, o le maualuga ma le maualalo e le tatau ona i ai se aafiaga, e pei o le fluorescent dyes ma dNTPs.O le mea moni, afai lava e fa'atumauina lelei le vevela fa'afefete, o le a fa'aitiitia le a'afiaga o le fa'amuamua ile tau Ct.
O le vevela faʻapipiʻi e faʻamalieina lelei, ma o le a faʻaitiitia le aʻafiaga o le faʻamuamua ile CT
O le fausaga lona lua e a'afia ai le lelei o le fa'alauteleina
Tatou ave le ata mai le Bio-rad e faʻaalia ai le faʻafitauli.O lo'o fa'atulagaina fo'i se fa'alili o le vevela e fa'amālosia ai se kenera e iai lona fausaga lona lua.
Fa'ailoga lona lua e tula'i mai
E mafai ona vaʻaia a o faʻaitiitia le faʻaitiitia o le vevela, e amata ona aliali mai oloa ma agai i luma le tau Ct, e oʻo atu i le tau maualalo i le 60.7 ° C, ona faʻaitiitia ai lea o le faʻafefe o le vevela, faʻateleina le tau Ct.I le isi itu, a oʻo ina faʻatuputeleina le vevela, e matala le fausaga lona lua ma faʻateleina le faʻaleleia atili.A maeʻa ona oʻo i se vevela, faʻateleina le vevela e le mafai ona faʻaleleia le faʻaleleia atili.Aua e le mafai ona tu'u fa'atasia fa'amau i le taimi nei.O le mea lea,su'e le vevela o lo'o iai le tau maualalo Ct, o le vevela sili lea mo le faʻalauteleina o le faʻataʻitaʻiga lona lua!O le mea moni, e tatau i tagata valea atamai ona iloa afai e le manaʻomia, e sili ona lelei le suia o faʻailoga ma aloese mai le faʻafanua lona lua.
5. Tulaga fa'aoga
MIQE—Su'esu'ega o Fa'amaumauga
Ole su'esu'ega o fa'amaumauga e tele lava ina tu'uina mai e le meafaifa'aili ole PCR fa'ata'ita'i.I le tusiga talu ai, o le tele o suʻesuʻega o faʻamaumauga na faia, e pei o le avanoa avanoa, lea na faʻamatalaina i le mamanu o le suʻega.O kenera faʻasino i totonu, numera toe fai, ma isi ua faʻamalamalamaina., o iinei matou te faʻamatalaina tele le faʻaogaina o le qPCR.
qPCR e fa'aaogaina lautele, ma fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga ma su'esu'ega nucleic acid o fa'ata'ita'iga e masani ona fa'aaogaina.
fa'atusatusaga atoatoa
Ogalaau (muamua fa'atonuga) e iai se feso'ota'iga fa'atasi ma le numera o ta'amilosaga.E mafai ona maua se pupuni masani mai se tulaga fa'atasi ma le numera kopi muamua ua iloa, o lona uiga, e mafai ona maua le feso'ota'iga laina o le fa'atuputeleina.E tusa ai ma le tau Ct o le faʻataʻitaʻiga, o le faʻatonuga i totonu o le faʻataʻitaʻiga e mafai ona fuafua.Le aofaʻi o faʻataʻitaʻiga e aofia ai.
Metotia Fa'atatau Fa'atatau
E tatau ona fa'avae le fa'atusatusaga atoatoa i luga o le fa'asologa masani.Ina ia faia se faʻailoga masani, e manaʻomia se faʻataʻitaʻiga.E masani lava, o le tulaga masani o se plasmid e maua e ala i le faʻapipiʻiina o le kenera taulaʻi.Aisea ua avea ai ma plasmid?Ona o le DNA plasmid lapotopoto e sili ona mautu.Fa'amama le oloa masani ile 5 i le 6 gradients e tusa ai ma le fa'aluaina fua (10-dilution), ma fa'alogo lelei i le tutusa pe a fa'amalulu.Tuu le tau Ct e pa'u i le va o le 15-30.
Sauniuniga masani
I le taimi lava e tasi, o le faʻataʻitaʻiga e faʻataʻitaʻiina e tatau foi ona faʻafefeteina e tusa ai (manatua le dilution factor), ma o le tau Ct e tatau foi ona paʻu i le va o le 15-30.O le oloa masani + o le faʻataʻitaʻiga e faʻataʻitaʻiina e tuʻu faʻatasi i luga o le masini.Ina ua maeʻa le taʻavale, na faia se faʻailoga masani ma le mea masani, ma o faʻataʻitaʻiga e faʻataʻitaʻiina na aumai i totonu o le faʻasologa masani e faʻatatau ai le faʻatonuga.
Hepatitis B virus HBV quantification o se fa'atusatusaga fa'apitoa, lea e mafai ona fa'atatauina le numera kopi o siama ile 1ml o le toto.
Fuafuaga o numera kopi
Fa'ata'ita'iga fa'atonuga e su'eina (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × fa'ameamea
Fa'ata'ita'i mole mole mamafa = numera o fa'avae × 324
Le numera kopi o le faʻataʻitaʻiga e suʻe (kopi/ul) = o le faʻatonuga o le faʻataʻitaʻiga e suʻe / le mamafa mole o le faʻataʻitaʻiga × 6 × 1014
Fa'atatauga ole numera kopi
O loʻo i luga o le auala faʻatatau mo le fuafuaina o le aofaʻi.Ole fa'afitauli ole matematika lea e mafai ona fo'ia pe a uma ona fa'au'u mai le aoga maualuga, ma o fa'afitauli ole matematika e masani ona fo'ia e komepiuta.Afai e te le malamalama, e mafai ona e sau e talanoa.
fua faatatau
O fa'atusatusaga fa'atatau e masani ona fa'aaogaina i su'esu'ega fa'asaienisi.E fia fa'ama'i o lo'o iai i totonu o le 1ml o le toto, ma o le DNA virus, o se mea fa'amautu lea: e mafai ona fa'amautu le aofa'i o le toto, ma o le DNA virus e fai si mautu.Ae ui i lea, e faigata ia i tatou ona faʻatusatusa le numera o kopi o se gene i totonu o lau lau, aua e faigata ona fuafua le tele, mamafa, ma le agavaivai o le lau, o le aofaʻi o le RNA e maua mai e faigata ona fuafua, ma o le lelei o le faʻaliliuina o tusitusiga e faigata foi ona iloa, o lona uiga, soʻo se laʻasaga e mafai ona faʻaogaina ai faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga ma e le mafai ona faʻaaogaina.
O le mea lea, o le faʻatusatusaga faʻatusatusa e tatau ona faʻaalia se elemene:o le kenera faasinomaga totonu .
I se isi faaupuga, o le faʻatusatusaga faʻatusatusa o le mea moni o se faʻatusatusaga i le va o le kenera taulaʻi ma le kenera faʻasino i totonu.Pe a faatusatusa i le mea lava e tasi ma le sela lava e tasi, o le aafiaga o le lapoʻa o le faʻataʻitaʻiga, le aofaʻi o le faʻaaogaina o le RNA, faʻaliliuga faʻaliliuga lelei, ma le lelei o le PCR e laʻititi lava.Ona o le la'ititi o le fa'ata'ita'iga, o kenera fa'asino i totonu ma kene fa'atatau na fa'aitiitia.O le mea lea na matou fa'amamafa ai le tutusa ma le mautu muamua.
O kenera faasinomaga i totonu e masani lavagafa tau fale( genes-tausia o fale), lea e faasino i se vasega o kenera o loʻo faʻaalia i totonu o sela uma, ma o latou oloa e manaʻomia e tausia ai gaioiga masani o le ola o sela.
Aua le fenumiai lenei manatu.O kenera tausi fale o uiga fa'aola ola, a'o kene fa'asino i totonu o fa'amatalaga fa'apitoa fa'apitoa.E mana'omia ona pasi fa'amaoniga a'o le'i filifilia o kenera fa'asino i totonu.
Mo se faʻataʻitaʻiga, na matou filifilia ni kenera tausi fale i le ata o loʻo i lalo e faʻataʻitaʻi ai a latou faʻaaliga i totonu o sela eseese, ma iloa ai o le maualuga o faʻamatalaga o le β-2-microglobulin e matua ese lava mai i latou o isi genes e tolu, o lea e le mafai ai ona faʻaaogaina e avea ma kenera faʻasino i totonu.
A maeʻa ona malamalama i le galuega faʻasaʻo o le kenera faʻasinomaga i totonu, e lua algorithms e maua mai ona o le faʻaofiina o le kenera faasinomaga totonu.
· auala fa'alua fa'ata'amilosaga masani
·2 – △△Ct auala (CT fa'atusatusaga fa'atatau)
Afai e te fiafia i le suʻesuʻeina o ituaiga meaola ma gaio, faʻamolemole tuʻu le suʻesuʻega i algorithms ma faʻaoga saʻo fua, pe faʻaoga saʻo masini;afai o oe o se tama sa'o ile matematika ma inisinia, faamolemole lagona le saoloto.
auala fa'ailoga fa'alua
Fa'ata'ita'i le kenera fa'atatau ma le fa'ameafale o le fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga ma le fa'ata'ita'iga e fa'ata'ita'iina e ala i le fa'asologa masani, ona fa'atatau lea o le tau fa'atatau e tusa ai ma le fua fa'atatau, o le fa'aaliga fa'atusa.
Tulaga lelei: su'esu'ega faigofie, fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga faigofie
Le lelei: Mo kene ta'itasi, ta'amilosaga ta'itasi o su'ega e tatau ona fai se pi'o masani
Talosaga: O se tasi o auala e lua e masani ona fa'aogaina ma fa'ailoaina fa'atusatusaga fa'atatau ile su'esu'ega ole fa'atonuga ole fa'amatalaga o kenera
O le fua fa'atatau e fa'apea:
O fa'ata'ita'iga e fa'apea:
Fa'atatau le aofa'i fa'atatau ile fua fa'atatau
2 – △△Ct auala (CT fa'atusatusaga fa'atatau)
Tulaga lelei: E le manaʻomia le faia o se faʻailoga masani
Faʻaletonu: E faʻapea o le faʻamalosia o le faʻaleleia e latalata ile 100%;o le faʻasologa masani o le <5%, ma o le faʻasologa masani ma le lelei i le va o faʻaopoopoga taʻitasi e faʻapea e tutusa;e sili atu ona lavelave le fa'asilisiliina o tulaga fa'ata'ita'i.
Talosaga: O se tasi o auala e lua e masani ona fa'aogaina ma fa'ailoaina fa'atusatusaga fa'atatau ile su'esu'ega ole fa'atonuga ole fa'amatalaga o kenera
O le mea moni, o le faʻaleleia lelei e masani lava ona le mafai ona atoatoa 1. Faʻasaʻo auala: Afai tatou te iloa o le kenera taulaʻi ma le kenera faʻasino e tutusa lelei le faʻalauteleina, ae o le faʻaleleia lelei e le tutusa ma le 1, ona mafai lea ona faʻasaʻo le 2－△△Ct e pei o: (1 + E ) －△△Ct0.llification e mafai ona faʻasaʻo, pe afai o le Ct0.llification e mafai ona faʻasaʻo le faʻataʻitaʻiga. 1.95－△△Ct
E oʻo mai i le taimi nei, o le anotusi e uiga i le PCR quantitative fluorescent ua maeʻa.
Taimi meli: Apr-06-2023
