Fa'avae mamanu muamua (99% fa'afitauli e mafai ona foia)
1. Ulua'i umi: O le tusi a'oga e mana'omia le 15-30bp, masani e tusa ma le 20bp.O le tulaga moni e sili atu le 18-24bp e faʻamautinoa ai le faʻapitoa, ae o le umi o le sili atu, o le umi o le amataga o le a faʻaitiitia ai le faʻapitoa, ma faʻaitiitia ai le fua.
2. Primer amplification span: 200-500bp e talafeagai, ma o le vaega e mafai ona faʻalauteleina i le 10kb i lalo o tulaga faʻapitoa.
3. Fa'avae muamua: O mea o lo'o i totonu o le G + C e tatau ona 40-60%, e le lelei tele le fa'atupuina o le G + C, o le tele o le G + C e faigofie ona fa'aalia ni fusi e le o fa'apitoa.ATGC e sili ona tufatufa faʻafuaseʻi, aloese mai fuifui o sili atu i le 5 purine poʻo pyrimidine nucleotides.Multi-gc mo le 5' fa'ai'uga ma le vaeluaga fa'asologa e fa'ateleina le mautu, aloese mai le mauoa GC i le 3' fa'ai'uga, leai se GC mo fa'avae 3 mulimuli, po'o leai se GC mo le 3 o fa'avae mulimuli 5.
4. Aloese mai fausaga lona lua i primers, ma aloese mai le felagolagoma'i i le va o primers se lua, ae maise le fa'amaopoopo i le 3 'i'uga, a leai o le a faia le dimer primer ma o le a fa'atupula'ia fusi fa'apitoa.
5. O fa'avae i le 3 'i'uga o primers, aemaise lava fa'amaufa'ailoga mulimuli ma fa'amaufa'ailoga mulimuli, e tatau ona fa'atasi lelei ina ia aloese mai le fa'aletonu o le PCR ona o fa'avae fa'amau e le'i fa'atasi.
6. E iai pe e mafai fo'i ona fa'aopoopo fa'amatamata fa'atasi ai ma nofoaga e tata'i ai, ma o le fa'asologa o fa'asologa fa'alautele e tatau ona iai ni nofoaga e tata'i ai, lea e aoga tele mo le su'esu'eina o le cleavage po'o le molecular cloning.
7. Fa'apitoa o fa'amuamua: e le tatau ona i ai se fa'ata'ita'iga fa'atasi ma isi fa'asologa i totonu ole fa'amaumauga ole fa'asologa ole nucleic acid.
8. A'oa'o e fa'aoga polokalame: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (E sili ona aoga le mamanu i luga ole laiga).
O mea o lo'o i luga e mafai ona fo'ia a itiiti ifo i le 99% o fa'afitauli fa'avae muamua.
Pulea fa'amatalaga o le mamanu muamua
1. Ulua'i umi
Ole umi ole amataga ole 18~30 fa'avae.I se tulaga lautele, o le mea pito sili ona taua e fuafua ai le vevela faʻafefe o le mea muamua o le umi o le faʻavae.E masani ona filifilia le vevela faʻafefe o le mea muamua (Tm tau -5 ℃), ma o nisi e faʻaaoga saʻo Tm tau.O fua fa'atatau nei e mafai ona fa'aogaina e fa'atatau ai le vevela o le fa'amaluluina o fa'amalama.
Pe a la'ititi ifo ile 20bp le umi ole fa'avae: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Pe a sili atu le umi o le primer nai lo 20bp: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (%GC) -500/umi-5 ℃
E le gata i lea, o le tele o polokalama e mafai foi ona faʻaaogaina e faʻatatau ai le vevela o le annealing, o le a ese le faʻatulagaina o mataupu faavae, o nisi taimi o le tau fuafuaina e mafai ona i ai se va itiiti.Ina ia fa'amalieina tali PCR, o fa'amatalaga sili ona pu'upu'u e fa'amautinoaina le vevela o le vevela e le itiiti ifo i le 54 ℃ e fa'aaogaina mo le sili ona lelei ma fa'apitoa.
I le aotelega, o le tulaga fa'apitoa e fa'aopoopoina i se vaega o le fa mo nucleotide fa'aopoopo ta'itasi, ma o le umi la'ititi mo le tele o fa'aoga e 18 nucleotides.Ole tapula'a pito i luga ole umi ole amataga e le taua tele, e fa'atatau ile tali lelei.Ona o le entropy, o le umi o le mea muamua, o le maualalo lea o le fua e pipii ai i le DNA taulaʻi e fausia ai se faʻataʻitaʻiga faʻamaufaʻalua mo le DNA polymerase e fusifusia.
Pe a fa'aogaina le polokalame e fa'ata'ita'i ai fa'ailoga, e mafai ona fa'amauina le umi o fa'amata'aga e ala i le tau TM, ae maise lava mo fa'auluuluga ole PCR fa'atele, TM=60℃ po'o le mea e tatau ona pulea.
2.GC anotusi
E masani lava, o le anotusi o le G + C i sequence muamua e 40% ~ 60%, ma GC anotusi ma Tm tau o se pea o primers e tatau ona faamaopoopoina.Afai o le fa'avae e iai se fa'alavelave matuia o le GC po'o le AT, e mafai ona fa'aopoopo le aofa'i talafeagai o le si'usi'u A, T po'o le G ma le C i le pito 5 'o le fa'ailoga.
3. vevela fa'afefe
O le vevela o le fa'afefe e tatau ona 5 ℃ la'ititi nai lo le vevela e le fa'aogaina.Afai e laʻititi le numera o faʻavae faʻavae, e mafai ona faʻateleina le vevela o le annealing, lea e mafai ona faʻateleina ai le faʻapitoa ole PCR.Afai e tele le numera o faʻavae, e mafai ona faʻaititia lelei le vevela o le annealing.O le eseesega o le vevela o le vevela i le va o se paʻu o le 4 ℃ ~ 6 ℃ o le a le aʻafia ai le fua o le PCR, ae o le mea e sili ona lelei o le vevela faʻafefe o se paʻu muamua e tutusa, lea e mafai ona eseese i le va o le 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Aloese mai le vaega lona lua o le fausaga o le fa'ata'ita'iga fa'alautele
E sili ona aloese mai le vaega lona lua o le fausaga o le mamanu pe a filifilia le vaega faʻateleina.O le fa'atulagaina lona lua mautu o le vaega fa'atatau e mafai ona va'ai ma fa'atatauina e komipiuta fa'akomepiuta talafeagai, lea e fesoasoani mo le filifilia o fa'ata'ita'iga.O fa'ai'uga fa'ata'ita'iga e fa'aalia ai e masani ona le manuia le fa'alautelega pe a la'ititi ifo i le 58.6lkJ/mol le malosi fua (△G) o le itulagi e fa'alautele.
5. Le fetaui ma le DNA taula'i
Pe a tele le fa'asologa o le DNA taula'i fa'alautele, e mafai ona pipi'i se fa'avae i le tele o vaega o le DNA fa'amoemoe, ma i'u ai i le tele o fusi e aliali mai i le i'uga.O le taimi lenei e tatau ona faʻaaoga le suʻega polokalama BLAST, upega tafaʻilagi:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Filifili Fa'asoa fa'asologa se lua (bl2seq).
Fa'apipi'i fa'asologa muamua i le sone 1 ma fa'asino le DNA fa'asologa i le sone 2 e mafai ona fesuia'i, ma e fa'atatau e le BLAST mea fa'aopoopo, antisense, ma isi avanoa, o lea e le mana'omia ai e tagata fa'aoga ona iloa pe o filifili uma e lua o ni filifili.E mafai foi ona e ulufale i le numera GI pe afai e te iloa le numera GI o le faasologa i totonu o le database, o lea e te le tau faapipiiina ai se vaega tele o le faasologa.Mulimuli ane, kiliki Align i le 3 e va'ai pe o lo'o i ai le tele o nofoaga tutusa i le DNA taula'i.
6. Fa'ailoga muamua
O le pito 3 'o le amataga o le mea lea e amata ai le faʻaopoopoga, o lea e taua ai le puipuia o le le fetaui mai le amataina iina.O le 3 'i'uga e le tatau ona sili atu i le 3 G po'o le C soso'o, aua o le a mafua ai ona fa'aoso sese le fa'amuamua i le fa'asologa o le fa'atamaoaigaina o le G+C.Ole pito 3 e le mafai ona fausia so'o se fausaga lona lua, se'i vagana i tali fa'apitoa PCR (AS-PCR), e le mafai ona fa'afeagai le fa'ai'uga 3' ole primer.Mo se faʻataʻitaʻiga, afai e faʻateleina le faʻaogaina o le itulagi, e le tatau ona faʻamutaina le 3 'iuga o le primer i le tulaga lona tolu o le codon, aua o le tulaga lona tolu o le codon e faigofie ona faʻaleagaina, lea o le a aʻafia ai le faʻapitoa ma le lelei o le faʻalauteleina.Pe a fa'aogaina mea fa'apipi'i, va'ai i le laulau fa'aoga codon, fa'alogo lelei i mea ola, 'aua ne'i fa'aogaina mea fa'apipi'i i le fa'ai'uga 3', ma fa'aoga le maualuga maualuga o fa'amalama (1uM-3uM).
7. Fa'atulagaga lona lua o fa'avae
E le tatau ona i ai ni fa'asologa fa'atasi o fa'auluuluga, a leai o le a gaugau le fa'auluulu i totonu o fausaga lauulu, ma o lenei fausaga lona lua o le a a'afia ai le fusifusia o primers ma fa'ata'ita'iga ona o le fa'alavelave fa'alavelave.Afai e fa'aogaina le fa'amasinoga fa'apitoa, o fa'avae fa'aopoopo faifaipea o fa'avae e le tatau ona sili atu i le 3bp.E le tatau ona i ai se felagolagomai i le va o mea muamua e lua, ae maise o le felagolagomaʻi o le pito 3 e tatau ona aloese e puipuia ai le faʻavaeina o dimers muamua.I se tulaga lautele, e le tatau ona sili atu i le 4 fa'avae fa'asolosolo fa'atasi po'o le fa'atasi i le va o se pa'aga fa'avae.
8. Fa'aopoopo fa'ailoga po'o loci
O le 5 'i'uga e itiiti sona a'afiaga i le fa'alauteleina o le fa'apitoa ma o lea e mafai ai ona fa'aleleia e aunoa ma le a'afiaina o le fa'apitoa.O le suiga o le fa'ai'uga muamua 5 e aofia ai: fa'aopoopoina le nofoaga fa'asaina ole enzyme;Fa'ailogaina o le biotin, fluorescence, digoxin, Eu3+, ma isi. Fa'ailoa le fa'asologa o DNA e fusifusia ai porotini;Faʻafeiloaʻi nofoaga o suiga, faʻapipiʻi ma misia faʻasologa o suiga ma faʻafeiloaʻi faʻasologa faʻasalalauga, ma isi.O fa'asologa fa'aopoopo e le o iai i luga o le fa'asologa fa'asologa, e pei o nofoaga fa'atapula'a ma fa'asologa fa'alauiloa, e mafai ona fa'aopoopo i le 5' pito o le fa'amuamua e aunoa ma le a'afiaina o mea fa'apitoa.O nei fa'asologa e le o aofia ai i le fa'atusatusaga o tau Tm muamua, ae tatau ona fa'ata'ita'iina mo le fa'atasi ma le fa'atulagaga lona lua i totonu.
9. Subclones
O le tele o taimi, o le PCR e na o le faʻapipiʻiina muamua, ona manaʻomia lea ona tatou faʻapipiʻiina le vaega o loʻo taulaʻi i totonu o vectors eseese, o lea e manaʻomia ai ona tatou mamanuina faʻavae faaopoopo mo le isi gaioiga i le laasaga PCR.
O nisi fa'asologa ua fa'atulagaina mo le fa'a-cloning o lo'o aoteleina i lalo.
Fa'aopoopo le nofoaga fa'atapula'a endonuclease
O le fa'aopoopoina o nofoaga fa'atapula'a o le enzyme o le auala sili lea ona fa'aogaina mo le fa'aogaina o oloa PCR.E masani lava, o le nofoaga cleavage e ono faavae, i le faaopoopo atu i le 5 'iuga o le nofoaga cleavage manaomia e faaopoopo 2 ~ 3 faavae puipuiga.Ae ui i lea, o le numera o faʻavae puipuia e manaʻomia e enzymes eseese e ese.Mo se fa'ata'ita'iga, e le mana'omia e SalⅠ se fa'avae puipui, EcoRⅤ e mana'omia le 1 fa'avae puipui, E leaiⅠ mana'omia ni fa'avae puipui se 2, ma le Hind Ⅲ e mana'omia ni fa'avae puipui se 3.
LIC faaopoopo le si'usi'u
O le igoa atoa o le LIC o le Ligation-Independent cloning, o se auala faʻapipiʻi na faia e Navogen faʻapitoa mo lana vaega o le pET vector.O le la'u pET na saunia e le LIC e iai pito pipii e 12-15 fa'avae e tasi, e fa'aopoopo i pito pipi'i tutusa i luga o le vaega fa'apipi'i.Mo fa'amoemoega fa'alautele, o le fa'asologa muamua 5′ o le fasi vaega fa'aofiina e tatau ona fa'atutusa ai le ve'a LIC.O le 3'→5' gaioiga fa'aopoopo a le T4 DNA polymerase e mafai ona fausia se manoa pipi'i e tasi i luga o le fasi vaega fa'aofi pe a uma se taimi pu'upu'u.Talu ai ona o le oloa e mafai ona faia na o le annealing soofaatasi o le vaega faaofi saunia saunia ma le vector, o lenei metotia e matua vave ma lelei, ma o loʻo faʻatonuina cloning.
Fa'atonu TA clone faaopoopo si'usi'u
O le TA cloning na le mafai ona faʻapipiʻi le vaega i totonu o se vector, o lea na faʻaalia ai e Invitrogen se veʻa e mafai ona faʻaogaina le faʻapipiʻiina, lea o loʻo iai le faʻavae iloga GTGGS i le tasi pito.O le mea lea, i le mamanu o PCR primers, e tatau ona faʻaopoopo faʻasologa faʻatasi e tusa ai, ina ia mafai ona "faʻaogaina vaega".
Afai e puupuu lou taimi, e mafai ona e taumafai tuusaʻo faʻasologa, tuʻufaʻatasia le gene ma le vector, lea matou te taʻua ET gene synthesis i musika.
D. In-Fusion auala cloning
Leai se ligase manaʻomia, leai se tali umi e manaʻomia.O le umi lava e faʻaalia ai se faʻasologa i pito uma e lua o le vector linearized I le mamanu o primers, ona faʻaopoopoina lea o le PCR product ma le linearized vector i le in-fusion enzyme solution o loʻo i ai le BSA ma tuʻu i le vevela o le potu mo le afa itula, e mafai ona faia le suiga.O lenei metotia e fetaui lelei mo le liua tele o le voluma.
10. Fa'atasi muamua
O nisi taimi, na'o fa'amatalaga fa'asologa fa'atapula'a e iloa e uiga i le mamanu muamua.Mo se faʻataʻitaʻiga, afai e naʻo le faʻasologa o le amino acid e iloa, o le faʻapipiʻi muamua e mafai ona mamanuina.O se fa'avae tu'ufa'atasi o se fa'afefiloi o fa'asologa 'ese'ese e fai ma sui o avanoa fa'avae 'ese'ese uma e fa'asolo ai se amino acid e tasi.Ina ia faʻateleina le faʻapitoa, e mafai ona e vaʻai i le laulau faʻaoga codon e faʻaitiitia ai le faʻapipiʻi e tusa ai ma le faʻaogaina o mea e fiafia i ai o meaola eseese.Hypoxanthine e mafai ona faʻapipiʻi faʻatasi ma faʻavae uma e faʻaitiitia ai le vevela faʻafefe o le mea muamua.Aua ne'i fa'aogaina fa'avae fa'apipi'i i le pito 3' o le fa'avae aua o le fa'amauina o fa'avae mulimuli e 3 i le pito 3' ua lava lea e amata ai le PCR i le nofoaga sese.E sili atu le maualuga o fa'atonuga (1μM i le 3μM) e fa'aoga ona o fa'amuamua i le tele o fa'afefiloi fa'aopoopo e le fa'apitoa i le fa'ata'ita'iga fa'atatau.
PCR meafaitinopulea
1. Aofa'iga muamua
O le faʻatonuga o faʻamaumauga taʻitasi o le 0.1 ~ 1umol poʻo le 10 ~ 100pmol.E sili atu le tu'uina atu o le fa'ai'uga mana'omia ma le aofa'i pito i lalo ole primer.O le maualuga o le fa'auluuluga o le mea muamua o le a mafua ai le le fetaui ma le le fa'apitoa o le fa'alauteleina, ma fa'ateleina ai le avanoa e fau ai dimer i le va o primer.
2. Fa'atonuga muamua
O le faʻaogaina o primers e aʻafia ai le faʻapitoa.Ole fa'atonuga sili ona lelei e masani lava ile va ole 0.1 ma le 0.5μM.Ole maualuga ole fa'amata'aga e ta'ita'i atu ai ile fa'ateleina o oloa e le fa'apitoa.
3. Su'ega vevela o le mea muamua
O le isi fa'amaufa'ailoga taua mo primers o le vevela o le liusuavai (Tm).O le vevela lea pe a fa'atusaina le 50% o fa'asologa fa'atasi ma fa'asologa fa'atasi e pei o molelaula DNA fa'alua.E mana'omia le Tm e seti ai le vevela o le PCR.O le mea lelei, e lava le maualalo o le vevela faʻapipiʻi e faʻamautinoa ai le faʻaogaina lelei o mea muamua ma le faʻasologa faʻasologa, ae lava le maualuga e faʻaitiitia ai le fusifusia e le faʻapitoa.Talafeagai le vevela vevela mai le 55 ℃ i le 70 ℃.E masani ona seti le vevela ole 5℃ i lalo ole Tm ole mea muamua.
E tele fua fa'atatau mo le fa'atulagaina o le Tm, lea e matua'i fesuisuia'i e fa'atatau i le fua fa'aaoga ma le fa'asologa o mea muamua.Ona o le tele o fua fa'atatau o lo'o maua ai se tau Tm, o le vevela fa'afefe uma ua na'o se amataga.E mafai ona fa'aleleia le fa'apitoa e ala i le su'esu'eina o le tele o fa'agaioiga e fa'agasolo ai le si'itia o le vevela fa'afefe.Amata i lalo ole fua faatatau Tm-5 ℃, ma faasolosolo fa'atuputeleina le vevela fa'afefe ile fa'aopoopoga ole 2 ℃.O le maualuga o le vevela faʻafefete o le a faʻaitiitia ai le faʻavaeina o dimers muamua ma oloa e le faʻapitoa.Mo fa'ai'uga sili ona lelei, e tatau ona i ai fa'atatau Tm i fa'amatalaga muamua e lua.Afai o le eseesega Tm o paga muamua e sili atu i le 5 ℃, o le a faʻaalia e faʻamatalaga se amataga sese tele e ala i le faʻaogaina o le vevela faʻafefe maualalo i le taamilosaga.Afai e ese'ese ia mata'itusi e lua Tm, fa'atulaga le vevela fa'afefe i le 5℃ maualalo ifo nai lo le Tm pito maualalo.I le isi itu, ina ia fa'ateleina le fa'apitoa, e mafai ona fa'atino muamua ta'amilosaga e lima i le vevela fa'amanaina ua fuafuaina mo le Tm maualuga, soso'o ai ma ta'amilosaga o lo'o totoe i le vevela fa'anatina ua fuafuaina mo le Tm maualalo.O lenei mea e mafai ai ona maua se kopi vaega o le faʻataʻitaʻiga i lalo o tulaga faigata.
4. Muamua mama ma mautu
O le mama masani o mea masani masani e fetaui lelei mo le tele o talosaga PCR.O le aveeseina o le benzoyl ma le isobutylyl vaega e ala i le desalting e laʻititi ma o lea e le faʻalavelave ai i le PCR.O nisi tusi talosaga e mana'omia le fa'amamāina e aveese ai so'o se fa'asologa e le'o atoa le umi i le fa'agasologa o fa'asologa.O nei faʻasologa faʻasolosolo e tupu ona o le lelei o le DNA synthesis chemistry e le 100%.Ose fa'agasologa lapotopoto lea e fa'aogaina ai fa'agasolo fa'a-kemikolo a'o fa'aopoopo fa'avae ta'itasi e fai ai le DNA mai le 3′ i le 5′.E mafai ona e toilalo i soo se taamilosaga.O fa'asologa umi, ae maise lava e sili atu nai lo le 50 fa'avae, e tele se vaega o fa'asologa ua tipi ma e ono mana'omia le fa'amamaina.
O le fua o primers e aʻafia i le lelei o le kemisi synthetic ma le faʻamamaina o auala.Kamupani biopharmaceutical, e pei o Cytology ma Shengong, faʻaaogaina uma le vaega ole OD e faʻamautinoa ai le aofaʻi o gaosiga ole oligonucleoside.O fa'ameamea fa'apitoa o lo'o fa'auluina ile fa'amago pauta.E sili atu le toe faʻamavaeina o primers i TE ina ia o le faʻatonuga mulimuli e 100μM.E sili atu le TE nai lo le vai fa'a'ele'ele ona o le pH o le vai e masani ona fa'asa'o ma o le a mafua ai le fa'asusu o oligonucleosides.
O le mautu o primers e faalagolago i tulaga teuina.E tatau ona teu i le -20 ℃ le paʻu mago ma faʻamaʻi solo.Primers solo i TE i concentrations sili atu i le 10μM e mafai ona stably teuina i -20 ℃ mo 6 masina, ae mafai ona teuina i le vevela potu (15 ℃ i le 30 ℃) mo le itiiti ifo i le 1 vaiaso.E mafai ona teuina fa'amago pa'u muamua i le -20 C mo le itiiti ifo i le 1 le tausaga ma i le vevela o le potu (15 C i le 30 C) mo le o'o atu i le 2 masina.
5. Enzymes ma o latou fa'atonuga
I le taimi nei, o le Taq DNA polymerase o loʻo faʻaaogaina o le faʻainisinia faʻainisinia o kenera na faʻapipiʻiina e siama coliform.Ole aofa'i ole enzyme e mana'omia e fa'ata'atia ai se tali masani a le PCR e tusa ma le 2.5U(fa'asino ile aofa'i ole tali ole 100ul).Afai e maualuga tele le faʻatonuga, e mafai ona taʻitaʻia ai le faʻalauteleina e le faʻapitoa;afai e maualalo tele le faʻatonuga, o le a faʻaitiitia le aofaʻi o oloa gaosia.
6. Tulaga lelei ma fa'atonuga o le dNTP
O le lelei o le dNTP e fesoʻotaʻi vavalalata ma le faʻatonuga ma le lelei o le PCR faʻateleina.O le pa'u o le dNTP e fa'atosina, ma o lona fesuisuia'i e leiloa lana gaioiga fa'aola pe a le teuina lelei.o le dNTP solution o le acidic, ma e tatau ona faʻaaogaina i le maualuga maualuga, faʻatasi ai ma le 1M NaOH poʻo le 1M Tris.HCL buffer solution e faʻafetaui ai lona PH i le 7.0 ~ 7.5, laʻititi laʻititi o sub-packaging, teuina faʻaisa i le -20 ℃.O le tele o le fa'a'aisa-liliu e fa'aleagaina ai le dNTP.I le PCR tali, dNTP e tatau ona 50 ~ 200umol/L.Aemaise lava, e tatau ona gauai atu i le faʻatonuga o le DNTPS e fa e tatau ona tutusa (tulaga tutusa mole sauniuni).Afai o le fa'atonuga o so'o se tasi oi latou e ese mai isi (maualuga pe maualalo), o le a mafua ai le le fetaui.O le maualalo o le faʻatonuga o le a faʻaitiitia ai le gaosiga o oloa PCR.dNTP e mafai ona tuʻufaʻatasia ma Mg2+ ma faʻaitiitia le faʻaogaina o le Mg2+ saoloto.
7. Fa'ata'ita'iga (ga'o fa'atatau) nucleic acid
Ole aofa'i ma le fa'amamāina o le fa'ata'ita'iga nucleic acid ose tasi lea o feso'ota'iga autu mo le manuia po'o le toilalo ole PCR.Ole auala masani ole fa'amamāina ole DNA e masani ona fa'aogaina le SDS ma le protease K e fa'alilo ma lafoa'i fa'ata'ita'iga.O galuega autu a le SDS o le: faʻamavaeina lipids ma proteins i luga o le membrane cell, ma faʻaumatia ai le membrane cell e ala i le faʻamavaeina o proteins membrane, ma faʻamavaeina polotini faaniukilia i totonu o le sela, e mafai foi e le SDS ona tuʻufaʻatasia ma polotini ma faʻafefe;E mafai e le Protease K ona fa'asusu ma fa'alili polotini, ae maise o histones o lo'o fusifusia i le DNA, ona fa'aaoga lea o le phenol solvent organic ma le chloroform e aveese mai ai polotini ma isi vaega sela, ma fa'aoga le ethanol po'o le isopropyl alcohol e fa'afefe ai le nucleic acid.O le nucleic acid ua maua e mafai ona fa'aaogaina e fai ma fa'ata'ita'iga mo tali PCR.Mo fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga lautele, e mafai ona fa'aogaina se auala vave ma faigofie e fa'amuta ai sela, lysate pathogens, fa'alilo ma aveese polotini mai chromosomes e fa'asa'oloto ai kenera taula'i, ma fa'aoga sa'o mo le fa'alauteleina o le PCR.RNA fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga e masani ona fa'aogaina le guanidine isothiocyanate po'o le protease K auala e puipuia ai le RNase mai le fa'aleagaina o le RNA.
8.Mg2+ fa'atonuga
Mg2 + o loʻo i ai se aafiaga taua i le faʻapitoa ma le gaosiga o le PCR faʻateleina.I le PCR masani, pe a oʻo i le 200umol / L le faʻaogaina o le dNTP eseese, o le faʻatonuga talafeagai o le Mg2 + o le 1.5 ~ 2.0mmol / L.O le maualuga o le Mg2 + e maualuga tele, e faʻaitiitia le faʻapitoa o le tali, e tupu le faʻalauteleina e le faʻapitoa, o le maualalo o le faʻaogaina o le a faʻaitiitia ai le gaioiga o le Taq DNA polymerase, e mafua ai le faʻaitiitia o mea faʻaalia.
O ion magnesium e a'afia ai le tele o vaega ole PCR, e pei ole DNA polymerase, lea e a'afia ai fua;O le isi faʻataʻitaʻiga o le faʻamaʻi muamua, lea e aʻafia ai le faʻapitoa.dNTP ma le mamanu e fusifusia i le magnesium ion, faʻaitiitia le aofaʻi o le magnesium ion e manaʻomia mo le gaioiga o le enzyme.O le maualuga o le magnesium ion concentration e eseese mo taitoalua muamua ma mamanu, ae o le PCR masani e amata fa'atasi ma le 200μM dNTP o le 1.5mM (fa'aaliga: Mo le taimi moni PCR quantitative, fa'aaoga le 3 i le 5mM magnesium ion solution ma se su'esu'ega fa'alelei).O le maualuga o fa'aputuga o ion magnesium fua e fa'atuputeleina ai fua, ae fa'atuputeleina fo'i le fa'aupuga fa'apitoa ma fa'aitiitia le fa'amaoni.Ina ia iloa le faʻatonuga sili ona lelei, o le faʻaogaina o le magnesium ion na faia i faʻaopoopoga o le 0.5mM mai le 1mM i le 3mM.Ina ia faʻaitiitia le faʻalagolago i le magnesium ion optimization, Platinum Taq DNA polymerase e mafai ona faʻaaogaina.Platinum Taq DNA polymerase e mafai ona fa'atumauina galuega i luga o le tele o fa'aputuga o le magnesium ion nai lo le Taq DNA polymerase ma o lea e mana'omia ai le fa'aitiitia o le fa'aleleia.
9. Pcr-fa'aopoopo fa'aopoopo
O le fa'asilisiliina o le vevela fa'afefeteina, mamanu muamua, ma le fa'aogaina o le magnesium ion e lava lea mo le fa'ateleina fa'apitoa o le tele o fa'ata'ita'iga;ae ui i lea, o nisi faʻataʻitaʻiga, e aofia ai i latou e maualuga le GC, e manaʻomia ni faiga faʻaopoopo.O mea faʻaopoopo e aʻafia ai le vevela o le DNA e maua ai se isi auala e faʻaleleia atili ai le faʻapitoa o oloa ma fua.E mana'omia le denaturation atoa o le mamanu mo fa'ai'uga sili.
E le gata i lea, o le fausaga lona lua e taofia ai le fusia muamua ma le faʻalauteleina o le enzyme.
PCR additives, e aofia ai le formamide, DMSO, glycerin, betaine, ma le PCRx Enhancer Solution, faʻaleleia le faʻalauteleina.O la latou auala e mafai ai o le faʻaitiitia o le vevela o le liusuavai, ma fesoasoani i le faʻaogaina o mea muamua ma fesoasoani i le faʻalauteleina o le DNA polymerase e ala i le vaega lona lua.O le PCRx Solution e iai isi fa'amanuiaga.Ole la'ititi ole magnesium ion e mana'omia pe a fa'aoga ile Platinum Taq DNA polymerase ma le Platinum Pfx DNA polymerase.O le mea lea, o le Platinum technique e tuʻufaʻatasia ma le faʻaopoopoga e faʻateleina ai le faʻapitoa aʻo faʻaitiitia le faʻalagolago i le auala lona tolu, le magnesium ion optimization.Mo faʻamanuiaga sili, o le faʻaogaina o mea faʻapipiʻi e tatau ona faʻaleleia, aemaise lava DMSO, formamide, ma glycerol, lea e taofia ai le Taq DNA polymerase.
10. Amata vevela
O le PCR amata vevela o se tasi lea o auala sili ona taua e faʻaleleia atili ai le PCR faʻapitoa e faʻaopoopo i le mamanu muamua.E ui lava o le vevela faʻaumiumi sili ona lelei o le Taq DNA polymerase e 72 ℃, o le polymerase e tumau pea le malosi i le vevela o le potu.O le mea lea, o oloa e le faʻapitoa e gaosia pe a maualalo le vevela o le taofiofia nai lo le vevela faʻafefe i le taimi o sauniuniga o le PCR tali ma i le amataga o le taamilosaga vevela.O le taimi lava e fausia ai, o nei oloa e le fa'apitoa e fa'apena lelei.E sili ona aoga le PCR o le Hot-start pe a fa'atapula'aina nofoaga o lo'o fa'aogaina mo le mamanu muamua i le nofoaga o elemene kenera, e pei o suiga i le saite, fa'aaliga cloning, po'o le fausiaina ma le fa'aogaina o elemene e fa'aaogaina mo le inisinia DNA.
Ole auala masani e fa'atapula'a ai le gaioiga ole Taq DNA polymerase ole saunia lea ole fofo ole PCR ile aisa ma tu'u ile masini PCR muamua fa'avevela.O lenei metotia e faigofie ma taugofie, ae e le faʻamaeʻaina le gaioiga o le enzyme ma o lea e le faʻaumatia atoa ai le faʻalauteleina o oloa e le faʻapitoa.
O le fa'amama vevela e fa'atuai ai le fa'atupuina o le DNA e ala i le taofia o se vaega taua se'ia o'o atu le masini PCR i le vevela o le denaturation.O le tele o metotia amata fa'amalama tusi lesona, e aofia ai le tuai fa'aopoopoina o le Taq DNA polymerase, e fa'alavelave, aemaise lava mo fa'aoga maualuga.O isi auala e fa'amama ai le vevela e fa'aaoga ai se talita ga'o e fa'apipi'i ai se vaega taua, e aofia ai ion magnesium po'o enzymes, po'o le tu'u'ese'ese fa'aletino o vaega fa'afoliga, e pei o fa'ata'ita'iga ma pa'u.I le taimi o le taamilosaga vevela, o vaega eseese e faʻasaʻoloto ma faʻafefiloi faʻatasi aʻo liusuavai le solo.E pei o le tusi lesona auala amata vevela, o le auala talipupuni ga'o e lavelave ma faigofie i le faaleagaina ma e le talafeagai mo talosaga maualuga throughput.
Platinum DNA polymerase e faigofie ma lelei mo PCR amata vevela otometi.Platinum Taq DNA polymerase e aofia ai le Recombinant Taq DNA polymerase fa'atasi ma le monoclonal antibody e faasaga i le Taq DNA polymerase.O antibodies e faia e le PCR e taofia ai le gaioiga o le enzyme i le taimi umi o le taofiofia o le vevela.Taq DNA polymerase na tatalaina i le tali i le taimi o le 94 ℃ insulation o le denaturation step, toe faʻafoʻi atoa le gaioiga polymerase.E ese mai i le Taq DNA polymerase ua suia mo le amataga o le vevela, e le manaʻomia e le enzyme Platinum le faʻaumiumi faʻafefe i le 94 ℃ (10 i le 15 minute) e faʻagaoioi ai le polymerase.Faatasi ai ma le PlatinumTaq DNA polymerase, 90% o Taq DNA polymerase gaioiga na toe faʻaleleia pe a maeʻa le 2 minute ile 94 ℃.
11. faamoega-PCR
O ta'amilosaga fa'asolosolo o fa'aopoopoga e fa'aaoga ai fa'amuaga fa'amoega e mafai ona fa'aleleia atili ai le fa'apitoa ma le ma'ale'ale.O le taamilosaga muamua o se faʻalauteleina masani o le 15 i le 20 taamilosaga.O se vaega itiiti o le oloa faʻateleina muamua na faʻafefeteina 100 i le 1000 taimi ma faʻaopoopo i le taamilosaga lona lua o le faʻalauteleina mo le 15 i le 20 taamilosaga.I le isi itu, o le oloa faʻateleina muamua e mafai ona faʻatusatusa i le faʻamamaina o gel.E fa'aaogaina se fa'aaufa'amua i le ta'amilosaga lona lua o le fa'aopoopoga, lea e mafai ona fusifusia i le fa'asologa o lo'o fa'atatau i totonu o le fa'asologa muamua.O le fa'aogaina o le nested PCR e fa'aitiitia ai le fa'atuputeleina o le tele o nofoaga fa'atatau ona e itiiti fa'asologa fa'asologa e fa'aopoopo i seti uma e lua.O le aofa'i tutusa o ta'amilosaga (30 i le 40) fa'atasi ai ma fa'amaufa'ailoga tutusa na fa'ateleina ai nofoaga e le fa'apitoa.O le Nested PCR e fa'atuputeleina ai le ma'ale'ale o fa'asologa fa'atapula'aina (fa'ata'ita'iga, mrnas e seasea) ma fa'aleleia atili le fa'apitoa o PCRS faigata (fa'ata'ita'iga 5′ RACE).
12. Fa'asolo i lalo PCR
O le alu ifo i lalo o le PCR e faʻaleleia atili ai le faʻapitoa e ala i le faʻaogaina o tulaga faʻafefe mo nai taamilosaga muamua o le PCR.O le taamilosaga e amata i le vevela faʻafefe e tusa ma le 5 ℃ maualuga atu nai lo le Tm fuafuaina, ona faʻaititia lea o taʻamilosaga taʻitasi i le 1 ℃ i le 2 ℃ seʻia oʻo i lalo ole Tm 5 ℃ le vevela.E na'o le fa'ata'ita'iga o lo'o i ai le fa'ata'ita'iga sili ona maualuga o le a fa'ateleina.O nei oloa o loʻo faʻaauau pea ona faʻalauteleina i taʻamilosaga mulimuli ane, faʻapipiʻiina i fafo oloa faʻateleina e le faʻapitoa.O le alu ifo i lalo o le PCR e aoga mo metotia e le o iloa ai le tikeri o le homology i le va o le faʻataʻitaʻiga ma le faʻataʻitaʻiga, e pei o le AFLP DNA fingerprinting.
Pusa PCR fa'atatau
PCR Easyᵀᴹ (Fa'atasi ai le vali)
Le 2 × PCR HeroTMFa'afefiloi faiga e maualuga atu le fa'apalepale i PCR iniseti nai lo le PCR Mix faiga masani, ma e mafai ona faigofie ona taulimaina PCR amplification o mamanu lavelave eseese.O le faiga faʻapitoa faʻaalia ma le maualuga o le Taq Hero e faʻaalia ai le tali a le PCR e sili atu le faʻaleleia atili, faʻapitoa ma le maaleale.
PCR Heroᵀᴹ (Fa'atasi ai le Pei)
Fa'ateleina le fa'aolaola lelei
E iai le 5'→3' DNA polymerase activity ma le 5'→3' exonuclease activity, e aunoa ma le 3'→5' exonuclease activity.
Taimi Moni PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Fa'apitoa—fa'alelei fa'alelei ma le vevela-amata Taq enzyme e mafai ona taofia le fa'ateleina le fa'apitoa ma le fa'avaeina muamua o le dimer.
Ma'ale'ale maualuga—e mafai ona iloa ni kopi maualalo o mamanu
O lo'o fa'aogaina e le pusa se mea fa'apitoa fa'aliliuga fa'aliliuga ole Foregene ma Foregene HotStar Taq DNA Polymerase tu'ufa'atasia ma se faiga fa'afoliga tulaga ese e fa'aleleia atili ai le fa'asili ma le fa'apitoa ole tali.
Taimi meli: Me-09-2023
