Fa'apitoa ole su'esu'ega
I le tele o tulaga, o le faʻamoemoega o le mamanu muamua o le faʻateleina lea o le faʻapitoa ole PCR.E fa'amauina lea i le tele pe itiiti ifo o le fa'atupuina o le va'aiga o le tele o fesuiaiga.O se tasi fesuiaiga taua o le faasologa i le 3'i'uga o le mea muamua.
O le mea taua, o su'esu'ega a le PCR ua fuafuaina mo le fa'apitoa e sili atu ona fa'atumauina le maualuga maualuga i luga o le lautele lautele, aua o le su'ega e le maua ai ni mea fa'aopoopo e le fa'apitoa, ma fa'atauva ai ma PCR reagents po'o le fa'alavelaveina o le fa'atupu fa'atuputeleina autu.
O le mea moni, i nisi tulaga, faʻapitoa e le o se mea e sili ona taua, mo se faʻataʻitaʻiga, pe a o le sini o le faʻatusatusaina o fesoʻotaʻiga vavalalata ae eseese faʻamaʻi, mamanu faʻapitoa, optimization ma faʻamaoniga tulaga e manaʻomia.
O le faʻafefeteina o le faʻafefeteina o se auala masani mo le iloiloina o le faʻapitoa o amplicons, a itiiti ifo i le tulaga pe faʻateleina se faʻamoemoe e tasi.Peita'i, e tatau ona fa'amamafaina e mafai ona fa'asesēina pupuni liusuavai aua, mo se fa'ata'ita'iga, e mafai ona a'afia i a'afiaga tu'ufa'atasia o fa'atama'i fa'apitoa ma fa'ata'ita'iga maualalo.
P5 |O lo'o fa'aalia e le fa'alili fa'asolo le suiga Tm e maua mai i su'esu'ega se lua o aofa'iga eseese o DNA taula'i e lua.
A. I le maualuga o fa'atonuga (ad)), e leai se dimer fa'amatagofie pe a mae'a le fuaina o le qPCR.A'o fa'aitiitia le fa'atonuga o fa'ata'ita'iga i le 50 kopi (e), o le a amata ona aliali mai se oloa e le fa'apitoa ma na'o le pau lea o le oloa i le fa'amaualalo pito maualalo (f).
B. Na fa'amauina e le su'ega tutusa Tms i fa'atonuga fa'atatau uma, ma e leai se dimer mata'utia e o'o lava ile pito maualalo (5 kopi).I le fa'aogaina o nei metotia e lua e su'esu'e ai, e leai ni mea fa'aopoopo na maua i NTCs.
O le P5 o loʻo faʻaalia ai pupuni faʻamavae na maua ma faʻataʻitaʻiga o loʻo iai le mamanu i faʻasalalauga eseese.O le P 5a o loʻo faʻaalia ai i le lua pito sili ona maualalo, o le Tms o oloa faʻalauteleina e le faʻapitoa e gaosia e maualalo ifo nai lo amplicons faʻapitoa.
E manino lava, e le mafai ona fa'atuatuaina le fa'aogaina o lenei metotia e su'e ai fa'amoemoe o lo'o i ai i le maualalo o fa'atonuga.
O le mea e malie ai, NTCs, ie, faʻataʻitaʻiga e leai se DNA, e leʻi faʻamauina (e le o faʻapitoa) faʻaopoopoga oloa, e faʻaalia ai e mafai ona auai le DNA genomic i tua i le faʻalauteleina / polymerization e le faʻapitoa.
O nisi taimi e le mafai ona fo'ia ia fa'amatalaga fa'amata'aga ma fa'alāpotopotoga le fa'apitoa, ae e masani ona mafai ona fa'ata'atia se auala e iloa ai e leai se fa'aopoopoga fa'apitoa i so'o se fa'ata'ita'iga fa'atonuga ma le NTC (P 5b).
Iinei, e oʻo lava i le faʻamauina o le faʻalauteleina o le faʻatonuga faʻatatau ma le Cq o le 35 o le a maua ai se faʻamalo faʻapitoa.E fa'apena fo'i, e le'i fa'aalia e NTC ni fa'ailoga o le fa'atuputeleina e le fa'apitoa.O nisi taimi, e mafai ona fa'alagolago le su'esu'ega i le ava a tina, ma e na'o le fa'atuputeleina e le fa'apitoa e iloa i nisi fa'aputuga fa'apipi'i, e ono feso'ota'i ma fa'aputuga Mg2+ eseese.
Maumau o le su'eina
O le faʻaleleia o Ta o se laasaga aoga i le faʻamaoniga faʻamaonia ma le faʻaogaina o le faʻaogaina o le qPCR.E maua ai se fa'aaliga tuusa'o o le malosi o le seti muamua e ala i le fa'aalia o le vevela (po'o le fua o le vevela) e maua ai le Cq maualalo e aunoa ma le fa'alauteleina o le NTC.
O le lua i le fa-fa'aeseeseesega i le maaleale atonu e le taua mo tagata e maualuga le mRNA faʻamatalaga, ae mo suʻega faʻataʻitaʻiga, atonu o lona uiga o le eseesega i le va o taunuuga lelei ma sese le lelei.
O meatotino a Ta o qPCR primers atonu e matua ese lava.O nisi su'ega e le malosi tele, ma afai latou te le faia i lalo o le tau sili ona lelei Ta o fa'avae, o le a vave ona pa'u.
E taua lenei mea ona o lenei ituaiga o suʻesuʻega e masani ona faʻafitauli i le lalolagi moni, ma o le mama o le faʻataʻitaʻiga, le faʻaogaina o le DNA, poʻo le i ai o isi DNA atonu e le sili ona lelei.
E le gata i lea, e mafai ona eseese le numera o kopi fa'atatau, ma o mea e fa'afo'i, ipu palasitika, po'o meafaigāluega atonu e ese mai i latou na fa'aaogaina pe a fa'atulaga le su'ega.
P6|O le fa'alili ole vevela e fa'aalia ai le malosi o le PCR.
A. Fa'aaoga le Bioline's Sensifast SYBR mastermix (numera fa'amaumauga BIO-98050) e fai ai le PCR ile cDNA na saunia mai le RNA ole fai'ai ole tagata.
B. Fa'aaogā le meafaigaluega a le Bio-Rad's CFX qPCR e fa'amaumau ai le fa'afanua fa'alautele ma le pupuni fa'amavae o apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Kalafi fa'alautele ma le fa'alili liusuavai o ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Fa'ateleina kalafi ma le fa'amavaega o le GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs fa'amaumauina i le eseese o le vevela vevela, fa'aalia le eseesega i le Cq fa'amauina i lalo ole 7C le fa'alili ole vevela.
O le P 6 o loʻo faʻaalia ai se taunuuga masani o se suʻega e le manaʻomia, lea na faia ai le qPCR i le faʻaaogaina o le gradient Tas i le va o le 59C ma le 67C (P 6a), faʻaaogaina faʻamuamua mo kenera e tolu o le faiʻai o le tagata.
E mafai ona iloa mai le kalafi faʻateleina o Opalin primers e mamao ese mai le lelei ona o lo latou pito sili ona lelei Ta e vaapiapi tele (Ata 6b), o lona uiga, o Cqs e salalau lautele, e mafua ai ona faʻatusatusa Cqs i lo latou lelei Cqs Low.
O lenei auala e iloa ai e le mautu ma e ono o'o atu ai i le fa'atuputeleina fa'aletonu.O le mea lea, e tatau ona toe faʻaleleia lenei paʻu muamua.E le gata i lea, o le suʻesuʻega faʻafefete faʻafefeteina (faʻapipiʻi) o loʻo faʻaalia ai o le faʻapitoa o lenei auala e iloa ai e mafai foi ona avea ma faʻafitauli, aua e eseese le faʻafefeteina o Ta taʻitasi.
O le auala e iloa ai le ACSBG1 o loʻo faʻaalia i le P 6c e sili atu le malosi nai lo le Opalin detection method i luga, ae o loʻo mamao lava mai le lelei, ma e foliga mai e mafai ona faʻaleleia.
Ae ui i lea, matou te faʻamamafa e leai se fesoʻotaʻiga talafeagai i le va o le malosi ma le faʻapitoa, aua o le faʻamavaeina o le faʻaogaina o lenei auala e iloa ai o loʻo faʻaalia ai le maualuga tutusa i Tas uma (faʻapipiʻi).
I le isi itu, o le suʻega malosi e sili atu ona faʻapalepale, e maua ai Cqs tutusa i le lautele o Tas, pei o le suʻega GFAP o loʻo faʻaalia i le P 6d.
O le eseesega i Cqs maua i le tutusa 8 tikeri Celsius laina e itiiti ifo i le 1, ma o le faʻamavaega curve (faʻaofi) faʻamaonia uiga faʻaalia i lenei vevela.E taua le matauina o le Tas fuafuaina ma le tulaga moni Ta atonu e matua ese lava.
E tele ta'iala ua fa'atulaga e fesoasoani ai i tagata su'esu'e e fa'ata'atia lelei fa'amuamua, o le tele o ia mea e fa'avae i luga o tulafono ua leva ona fa'amautu ma ua tele le gauai atu i le 3'i'uga o primers.E masani ona fautuaina e aofia ai se G poʻo C i le 3' pito ma lua G poʻo C faʻavae (GC clamp), ae le sili atu ma le lua o faʻavae mulimuli e 5.
I le faʻatinoga, o nei tulafono e mafai ona taʻitaʻia tagata suʻesuʻe, ae e le o saʻo i lalo o tulaga uma.
P7 |O le pito 3'o le fa'amuamua e itiiti sona a'afiaga i le fa'apitoa po'o le lelei.
A. Le tulaga o mea muamua mo le tagata HIF-1α (NM_181054.2) gene.
B. Fa'aaoga le Agilent Brilliant III SYBR Green tina ava malosi (Cat. Nu. 600882) e fa'ateleina ai mea su'ega se ono.
C. Kalafi fa'ateleina ma le liusuavai fa'amaumau e le Bio-Rad's CFX qPCR meafaigaluega ma 3′end primers.NTC o lo'o fa'aalia i le mumu.
D. Cqs fa'amaumauga o mea ta'itasi su'ega
Mo se fa'ata'ita'iga, o le fa'ai'uga i le P 7 e fete'ena'i ma le tulafono fa'ai'uga 3′.O mamanu uma e maua mai ai i'uga tutusa, ma na'o le lua tu'ufa'atasiga muamua e ta'ita'i atu ai i le fa'alauteleina le fa'apitoa ile NTC.
Ae ui i lea, e le mafai ona matou lagolagoina le aʻafiaga o le kilipa GC, aua i lenei tulaga, o le faʻaaogaina o le A poʻo le T i le maualuga o 30 faʻavae e le faʻaitiitia ai le faʻapitoa.
Su'ega C, lea e fa'ai'u ai le F primer i le GGCC, na fa'amauina Cqs i NTCs, e fa'ailoa mai ai e ono mana'o se tasi e 'alofia nei fa'asologa i le fa'ai'uga 30.Matou te fa'amamafa atu e na'o le pau lava le auala e iloa ai le fa'asologa pito sili ona lelei o le fa'asologa o se paga muamua o le su'esu'eina lea o nisi fa'ata'ita'iga muamua.
Fa'atelega lelei
O le mea taua, e ui lava e le mafai ona faʻamaonia le suʻesuʻeina o le PCR e le faʻapitoa, e mafai ona fetuunaʻi ma faʻateleina le faʻaleleia atili i le tele o auala eseese e ala i le suia o le enzyme, ava malosi, faʻaopoopoga, ma tulaga o le uila.
Ina ia iloilo le lelei o le suʻesuʻeina o le PCR, e sili ona lelei le faʻaaogaina o le faʻafefeteina o le 10 poʻo le 5 taimi le faʻaogaina o le nucleic acid, o lona uiga, o le "auala masani curve".
Afai e fa'aogaina PCR amplicons po'o DNA fa'akomepiuta e fa'atupu ai se pi'o masani, e tatau ona fa'afefiloi fa'asologa fa'asolosolo o nei sini ma se aofa'i faifaipea o le DNA (e pei o le genomic DNA).
P8 |Fua fa'afefete e iloilo ai le lelei ole PCR.
A. Fa'aaogā fa'amuamua mo HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ma R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC ma le Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (numera fa'amaumauga 600882) mo PCR ma tulaga fa'alili liusuavai.
B. 100 ng RNA na fa'aliliuina fa'aliliu, fa'afefeteina 2 taimi, ma fa'ata'ita'iga cDNA fa'afefiloi fa'asolosolo fa'afefeteina 5 taimi i le 1 ng DNA genomic tagata.O loʻo faʻaalia le faʻafefeteina o loʻo faʻaalia i totonu.
C. O le tali a le RT, fa'afefeteina, ma le fa'afefeteina fa'asologa na toe faia mo le fa'ata'ita'iga lona lua o le cDNA, ma o fa'ai'uga na tutusa.
P 8 o loʻo faʻaalia ai le lua faʻataʻitaʻiga, faʻaaogaina le auala e tasi e iloa ai i luga o faʻataʻitaʻiga cDNA eseese e lua, o le taunuuga e tutusa lelei, e uiga i le 100%, ma le taua o le R2 e tutusa foi, o lona uiga, o le tikeri o le fetaui i le va o faʻamatalaga faʻataʻitaʻiga ma le laina faʻasolosolo poʻo le faʻamaumauga Degree of linearity.
O pi'o fa'ata'atia e lua e fa'atusa, ae le tutusa lelei.Afai o le faʻamoemoe o le faʻatatauina saʻo o le sini, e tatau ona maitauina e le taliaina le tuʻuina atu o se kopi numera numera e aunoa ma le faʻamatalaina o le le mautonu
P9 |Fua le mautinoa e fesoʻotaʻi ma le faʻatusatusaga e faʻaaoga ai se piʻo masani.
A. Fa'aaogā fa'amaufa'ailoga mo le GAPDH (NM_002046) e fa'atino ai le PCR ma le liusua o le pi'o.F: ACAGTTGCCATGTAGACC ma le R: TAACTGGTTGAGCACAGG ma le Bioline's Sensifast SYBR mastermix (numera fa'amaumauga BIO-98050).
B. Siata fa'alautele, fa'alili liusuavai ma fa'asolo masani fa'amaumauina i le meafaigaluega a le Bio-Rad's CFX qPCR.
C. Kalafi fa'ata'amilosaga masani ma le 95% taimi fa'atuatuaina (CI).
D. O le numera kopi ma le 95% taimi fa'atuatuaina o tau Cq e tolu na maua mai i le fa'afefeteina o le vai.
O le P 9 o loʻo faʻaalia ai mo se suʻega sili ona lelei, o le fesuiaiga masani o se faʻasologa masani e tasi e tusa ma le 2 taimi (95% taimi faʻamaonia, laʻititi i le maualuga), atonu o le fesuiaiga laʻititi e mafai ona faʻamoemoeina.
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Taimi meli: Sep-30-2021
