RT-qPCR faʻataʻitaʻiga e aofia ai le faʻaaogaina o le RNA ma le iloiloga lelei, faʻaliliuga faʻaliliu ma le qPCR laasaga e tolu, o laʻasaga taʻitasi e tele ni puipuiga, o le a matou faʻaalia auiliili i lalo.

Ⅰ.Iloiloga lelei ole RNA

I le RT-qPCR faʻataʻitaʻiga, pe a maeʻa le faʻaaogaina o le RNA, e manaʻomia le suʻesuʻeina o le lelei o le RNA, ma e naʻo le faʻataʻitaʻiga tulitatao e mafai ona faia pe a maeʻa ona agavaa.Su'esu'ega metotia e aofia ai spectrophotometer, Agilent gel electrophoresis, Agilent 2100 auiliiliga, faatasi ai ma le spectrophotometer sili ona masani faaaogaina ma le agarose gel electrophoresis auala e iloa ai.E tatau ona maitauina o nei auala e lua e manaʻomia ona faʻaoga faʻatasi e faʻamaeʻa ai le suʻesuʻeina ma le auʻiliʻiliga o le faʻaogaina o le RNA, mama ma le faʻamaoni, ina ia mautinoa ai le lelei o le RNA.

Pusa Fa'aesea RNA Fa'atatau: 

Cell Total RNA Isolation Kit

E mafai ona maua le aofa'i atoa o le RNA fa'amama ma maualuga mai sela fa'aleaganu'u eseese ile 11min.

Manu Aofa'i RNA Isolation Kit

Fa'atopetope ma fa'alelei fa'amae'aina le maualuga-mama ma le maualuga o le aofa'i o le RNA mai aano o manu eseese.

Spectrophotometer:

O le spectrophotometer e masani ona faʻaaogaina e fuafua ai le faʻatonuga ma le mama o le RNA, ae e le mafai ona iloa le faʻamaoni o le RNA ma le genomic toega.Faatasi ai ma i latou, A260 / 280 ma A260 / 230 o ni vaega taua mo le RNA mama mama, ma RNA mama e mafai ona iloa e tusa ai ma fesuiaiga o latou tau:

1. 1.9< A260/280< 2.1, e ta'u mai ai e lelei le mama RNA;A260/280<1.9, e fa'ailoa mai ai e ono iai le palatini o totoe i le RNA;A260 / 280> 2.1, e faʻaalia ai le faʻaleagaina o se vaega o le RNA, lea e mafai ona faʻamaonia atili e le electrophoresis gel agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, e ta'u mai ai e lelei le mama RNA;A260/230<2.0, e fa'ailoa mai ai e ono iai toega o mea fa'aola i le RNA, e pei o phenols, ethanol po'o suka.

Agarose gel electrophoresis:

E mafai e le Agarose gel electrophoresis su'esu'ega ona su'esu'eina le amio sa'o o le RNA, genome ma palatini toega, ae le mafai ona fa'amauina sa'o le fa'atonuga o le RNA po'o le iloa o toega o mea fa'aola.Ave eukaryotic RNA templates mo se faʻataʻitaʻiga:

1. O le RNA na tuʻuina atu i le electrophoresis gel agarose.Afai e na'o le tolu fusi e tasi o le 28sRNA, 18sRNA ma le 5.8sRNA i luga o le fa'afanua gel, o lo'o fa'aalia ai o le RNA na maua mai o lo'o tumau.Afai o loʻo i ai se faʻalavelave toso, e faʻaalia ai le faʻaleagaina o le RNA.

2. Afai ei ai se fusi susulu tasi i le va o le pu kelu ma le 28sRNA fusi, atonu o loʻo i ai le genomic DNA toega.

3. Afai e aliali mai ni fusi i totonu o le pu kelu, e taʻu mai ai e ono iai ni toega o porotini ma isi mea macromolecular.

Ⅱ. Fa'aliliuga fa'aliliuga

A maeʻa le faʻaaogaina o le RNA, e manaʻomia ona toe faʻafoʻi i totonu o le cDNA mo suʻesuʻega mulimuli ane, o lea e manaʻomia ai le suiga.Fa'aliliuga fa'aliliuga o le a fa'aofi mai mai le filifiliga o fa'aliliuga fa'aliliu ma fa'amuamua:

Su'e transcriptase filifiliga:

O faʻamatalaga faʻasolosolo masani e aofia ai AMV RTase ma MMLV RTase.O le RNase H o le AMV RTase o loʻo i ai le malosi o le gaioiga, o le umi o le tuʻufaʻatasiga puʻupuʻu, maualalo le aofaʻi o le faʻaogaina ma le mautu lelei o le vevela (42 ~ 55 ℃).O le RNase H gaioiga a MMLV RTase e vaivai, o le umi o le tuʻufaʻatasiga e umi, o le aofaʻi o le tuʻufaʻatasiga e maualuga, ma e le lelei le mautu o le vevela (37 ~ 42 ℃).

Talu ai ona o le enzyme RNase H o loʻo i ai le galuega o le faʻaleagaina o le RNA template, o le MMLV faʻatasi ai ma le vaivai RNase H gaioiga e tatau ona filifilia lelei i le taimi o le faʻaliliuga, ma a maeʻa mulimuli ane faʻainisinia kenera, ua oʻo atu le mautu o le MMLV i se oso maualuga.Ave ForegeneForeasy Reverse Transcriptase(M-MLV mo le toe fa'aliliuga) e fai ma fa'ata'ita'iga, ose fa'aliliuga fou fa'aliliuga fa'aalia ile siama fa'ainisinia E. coli e fa'aogaina ai le fa'atekonolosi fa'asologa.O se DNA polymerase toe fa'aopoopoina e fa'apipi'iina se fusi DNA fa'atasi mai RNA, DNA, po'o se RNA: DNA hybrid.E leai se gaioiga RNase H, malosi mautu, malosi RNA affinity, ma maualuga lagona lagona.

 

Foreasy Reverse Transcriptase(M-MLV mo le toe fa'aliliuga)

Filifiliga muamua:

E masani lava ona pa'ū fa'avae RT i ni vaega se tolu: oligo dT, fa'asologa fa'afuase'i, ma fa'ama'i fa'apitoa mo gene.Filifili fa'amuamua talafeagai mo le fa'aoga e tusa ai ma manaoga fa'ata'ita'i eseese.

1. Afai o le mamanu e afua mai i le eukaryotic ma ua tuai le cDNA e fa'aoga mo le fa'alauteleina o le PCR masani, e fautuaina le Oligo (dT);Afai o le suʻega mulimuli e faʻaaogaina mo le qPCR, Oligo (dT) e fautuaina e faʻafefiloi ma faʻasologa faʻasolosolo e faʻaleleia ai le lelei o le faʻaliliuina o tusitusiga.

2. Afai o le mamanu e mai le prokaryotes, Random Primers po'o gene specific primers e tatau ona filifilia mo le toe fa'aliliuina.

Ⅲ.qPCR

O le fa'avasegaina o le fluorescence e masani lava ona fa'amanino mai le filifiliga o metotia fa'afuainumera, fa'avae mamanu fa'avae, filifiliga ROX, fa'asologa o faiga fa'afoliga ma le fa'atulagaina o tulaga, ma isi.

Filifiliga o metotia quantitative:

O metotia fa'afuainumera ua vaevaeina i metotia fa'atusatusaga fa'atatau ma metotia fa'atatau fa'atatau.E mafai ona faʻaogaina le faʻatusatusaga faʻatusatusa e iloa ai le aʻafiaga o nisi o togafitiga i luga o le faʻaaliga o le kenera, iloa le eseesega o le faʻaaliga o le kenera i taimi eseese ma faʻatusatusa le eseesega o le faʻaaliga o le gene i totonu o masini eseese.Ole fa'atatauina atoatoa e mafai ona iloa ai le aofa'i ole nucleic acid ile siama ma isi.I le faia o suʻega, e tatau ona tatou filifilia auala faʻatusatusa talafeagai e tusa ai ma a tatou lava suʻega.

Fa'avae mamanu autu:

O le mamanu o le mea muamua mo le qPCR e fesoʻotaʻi saʻo ma le faʻaleleia lelei ma le faʻapitoa o oloa.O le mea lea, o le faʻatulagaina saʻo lelei o faʻamuamua o le laasaga muamua lea o le qPCR manuia.I le mamanu o le faʻavae, o mataupu faavae nei e tatau ona gauai atu i ai pe a faʻafeiloaʻi le mataupu faavae o le mamanu masani masani:

1. O le umi o le vaega fa'atatau e pulea i le va o le 100 ma le 300 bp;

2. Cross-exon mamanu e aloese ai mai le aafiaga o genomic DNA;

3. E manaʻomia le faʻataʻitaʻiina o faʻataʻitaʻiga fuafuaina mo le faʻaleleia atili, ma naʻo le taimi e oʻo atu ai le faʻaleleia lelei o le tulaga (90-110%) e mafai ona faʻaaogaina mo faʻataʻitaʻiga quantitative;

4. Fa'atonuga muamua e masani ona fa'asilisiliina ile va ole 0.1uM ma le 1.0uM.

Filifiliga oROX:

I le faagasologa o le tali quantitative, ROX e mafai ona fetuutuunai le eseesega auala opitika, pipetting sese po o le leo eseesega e mafua mai le evaporation ma condensation tutusa, faaleleia le toe faia o taunuuga.Ae ui i lea, e tatau ona maitauina o le filifilia o ROX e fesoʻotaʻi ma le meafaigaluega.Afai o le meafaigaluega qPCR o loʻo i ai le galuega o le faʻasaʻoina otometi le eseesega i le va o pu, e le manaʻomia le faʻaopoopoina o le ROX;a leai, e manaʻomia le faʻaopoopoina o le faʻasaʻoga ROX.Paʻaga laiti i le faʻatauina o reagents e tatau ona tusa ai ma le meafaigaluega na faʻaaogaina e filifili ai le ROX saʻo, aloese mai mea sese mulimuli ane.

Sauniuniga o faiga tali:

Ole tele ole tali ole 20ul ma le 50ul e sili.O mataupu nei e tatau ona gauai atu i ai pe a faʻatulagaina le faiga:

1. E manaʻomia ona saunia le faiga faʻaalia e ala i le ea i totonu o le fale faigaluega ultra-mama, ddH fou₂O fa'aoga mo su'ega ta'itasi;

2. O fa'ata'ita'iga ta'itasi e mana'omia ona saunia le NTC e fa'amaonia pe o iai le filogia i totonu o le faiga, ma e mana'omia e ta'i pa'aga ta'itasi uma le NTC pe a saunia le faiga;

3. Ina ia iloa pe iai le gDNA toega i le RNA template, e mafai ona saunia le NRT mo faʻataʻitaʻiga taʻitasi mo le suʻeina;

4. Pe a saunia le faiga, e fautuaina e fai ia le itiiti ifo i le 3 faʻapitoa faʻapitoa mo le tasi faʻataʻitaʻiga;

5. A o le mamanu o le cDNA, e fautuaina e faʻafefe 5-10 taimi e faʻaitiitia ai le aʻafiaga o le faʻaogaina o le faʻaliliuga faʻaliliuga i luga ole suʻega qPCR.E sili atu le suʻesuʻeina o le numera faʻataʻitaʻiga e ala i le faʻasolosolo, ina ia pa'ū le tau o le CT i le va o le 20-30;

6. Fuafua le numera manaʻomia o tali, faʻatuputeleina i le 5-10% i luga o le faʻavae o le numera o tali, ma fuafua le numera o le faʻatulagaina o le voluma;

7, ua saunia le faiga e faʻaaoga ai le premix mataupu faavae, faʻafefiloi pe a maeʻa le centrifugation ma faʻamautinoa e leai ni faʻafefe;

8, I le mamao e mafai ai e filifili lagolago consumables.

Fa'atatau RT-qPCR Kit