RT-qPCR o le suʻesuʻega faʻavae o le biology mole, ma e tatau i tagata uma ona masani i ai.E masani ona aofia ai laasaga e tolu: RNA extraction, fesuia'i fa'aliliuga i le cDNA, ma le taimi moni fluorescent quantitative PCR.E le fesoasoani, o le a le mea o loʻo tupu?E foliga mai o loʻo i ai se faʻafitauli ile fa'ata'ita'iga fa'aliliuga!E ui lava e foliga mai o le faʻataʻitaʻiga faʻaliliuga e manaʻomia naʻo le faʻaopoopoina o le RNA, dNTP, primers, mafa'aliliuina transcriptasei le centrifuge tube ma faʻafefiloi lelei, ae i le faagasologa o le gaioiga moni, o loʻo i ai pea le tele o faʻamatalaga e manaʻomia ona gauai atu i ai.Sei o tatou aoao e uiga i ai!

E faʻafefea ona faʻamasino le lelei o le RNA?
Ina ia maua le cDNA, e taua tele le lelei o le RNA!O le lelei ole RNA e mafai ona iloa ile lua itu:
(1) Amiotonu RNA:RNA fa'amaoni e mafai ona fa'amaonia e le electrophoresis gel agarose. I le avea o eukaryotes o se faʻataʻitaʻiga, o le RNA atoa atoa e tolu fusi manino, o le mamafa mole mai le tele i le laʻititi o le 28S, 18S, ma le 5S, ma le 28S e faaluaina le malamalama nai lo le 18S;pe afai e mafai ona vaaia ni fusi se tolu, ae o le ituaiga faaili e faanenefu po'o le Fa'asalaina o lona uiga o le RNA ua fa'aleagaina se vaega.I le taimi nei, fa'amolemole fa'atino vave le fa'aliliuga fa'aliliuga ma fa'atele le fa'aoga fa'atusa talafeagai;afai e na o se fusi e iai sina mamafa mole mole pe leai se fusi e mafai ona vaʻaia, o le RNA ua matua faʻaleagaina ma e manaʻomia ona toe aveese .O le Agilent 2100 o loʻo faʻaalia ai le faʻamaoni o le RNA faʻatasi ai ma le ata pito i luga ma le tau RIN.Afai o le nucleic acid o loʻo tumau, o le laina faʻavae o le electropherogram e mafolafola;afai o le nucleic acid e matua faʻaleagaina, o le laina faʻavae e le tutusa ma sili atu le faʻaleagaina pito i luga;o le tau o le RIN e atagia ai le faʻamaoni o le RNA, i totonu o le va o le 0-10, o le tele o le tau, o le sili atu lea o le lelei o le RNA.Ia, o le maualuga o le tikeri o le atoatoa.
(2) Mama o le RNA:Ole fua ole OD260/280 e mafai ona iloa ile UV spectrophotometry.Afai ole fua ole OD260/280 i le va o le 1.9 ma le 2.1, o le mama e matua lelei lava.
O totoe genomic DNA e mafai ona taʻitaʻia ai iʻuga le saʻo
A aveese le RNA, o le RNA tatou te maua e mafai ona faʻafefiloi ma genomic DNA (gDNA) e leʻi faʻamamaina.O le mea lea, o le cDNA pe a maeʻa faʻaliliuga faʻaliliu o le a faʻafefiloi foi magDNA.I le taimi o le vai i laloqPCRtali,cDNAma gDNA e mafai ona faʻateleina i le taimi e tasi, e mafua ai le laʻititi laʻititi o le tau CT, o lea e ono faʻaituau ai iʻuga.
O le a la le mea e tatau ona tatou faia i lenei tulaga?Foregenefautua mai:
(1) Fa'atino le fa'amamāina o le genome i le RNA fa'aliliu, lea e mafai ona 'ave'esea e ala i le fa'aputuina o koluma i le taimi o le fa'aaogaina o le RNA;
(2) Togafiti le RNA ua maua mai ile DNaseI , ae faamuta i le EDTA;
o reagents transcription fa'aliliufa'atasi ai ma vaega fa'amama genome;

E fa'afefea ona filifili fa'amuamua mo fa'aliliuga fa'aliliu?
E a'afia ai fo'i le fa'ai'uga o le fa'aliliuga fa'aliliuga.E mafai ona e filifilia fa'asologa fa'afuase'i, Oligo dT po'o fa'ailoga fa'apitoa mo le fa'aliliuga fa'aliliu e tusa ai ma tulaga patino o le su'ega:
(1) Fa'amatalaga fa'apitoa: fa'avae fa'apitoa fa'apitoa e fautuaina;
(2) O fasipepa uumi: Oligo dT/gene-specific primers ua fautuaina;
(3) O vaega i totonu o tusitusiga o vaega uumi: fa'ailoga fa'apitoa e fa'atatau i le kenera/fa'ailoga fa'afuase'i/fa'ailoga fa'afuase'i + Oligo dT.Afai e faia le faʻataʻitaʻiga qPCR mulimuli ane, e le mafai ona faʻaaogaina na o Oligo dT, aua o le faʻaaogaina o Oligo dT naʻo ia e mafai ona mafua ai le faʻaituau o le 3', e mafua ai le le saʻo o le qPCR faʻataʻitaʻiga;
(4) miRNA: E mafai ona fa'aogaina ni fa'amaufa'ailoga fa'amau po'o ni fa'ama'i si'usi'u.

E fia taimi e tatau ona fa'afefeteina ai le cDNA oloa fa'aliliuga fa'aliliu mo le fa'atusatusaga?
A maeʻa ona maua le cDNA o le faʻaliliuga faʻaliliuga, e fia taimi e tatau ona faʻafefe ai le cDNA mo suʻega qPCR e taua tele.Afai e maualuga tele pe maualalo tele le fa'atonuga o le cDNA, e ono a'afia le fa'aleleia atili.E mafai ona fuaina le maualuga o le cDNA, ma fa'afefea ona fai?
(1) E le mafai ona fuaina le maualuga o le cDNA o le oloa faʻaliliuga, aua e le gata i le oloa cDNA, o loʻo i ai foʻi i le faʻaliliuga faʻaliliuga faʻasologa o totoe Buffer, faʻaliliuga transcriptase, primers, ma isi, lea o le a faʻalavelave i le fuaina o fua ma mafua ai le OD260 / 280, OD260 / 230.I le taimi nei, o le a fai mai nisi o uo, ona ou fuaina lea o le faʻatonuga pe a uma ona faʻamamāina;iinei, Foregene e manao e faamanatu atu e le fautuaina le cDNA e faamamaina, ona o le umi o le cDNA maua e le fesuiaʻiga e ese, ma o le cDNA puupuu o le a leiloa i le faamamaina.
(2) O le ā la le mea e fai?A'o le'i faia le fa'ata'ita'iga qPCR, e mafai ona fa'amauina le fa'alili o le fa'afefiloi o le cDNA e ala i le fa'ata'ita'iga muamua.Mo se fa'ata'ita'iga: fa'aaoga le cDNA stock solution, 10-fold dilution, ma le 100-dilution dilution e fai ma fa'ata'ita'iga mo su'ega qPCR, ma filifili le dilution factor ma le CT value i le va o le 18-28.

E fa'afefea ona fa'aliliu fa'aliliu le miRNA?
O le miRNA o se RNA laʻititi laʻititi e tasi le lapoʻa e tusa ma le 22 nt le tele e le faʻamaonia mo le polotini.Ona o lona umi puupuu, faiga masani qPCR e faigata ona faʻatatau tonu, o lea e masani ona manaʻomia le faʻalauteleina o le miRNA;o auala masani e fa'aaogaina fa'aliliuga fa'aliliu mo le miRNA e aofia ai le fa'amaufa'ailoga auala ma le auala si'usi'u.
O le auala-loop auala o le faʻalauteleina lea o le miRNA e ala i le faʻaopoopoina o faʻamaufaʻailoga faʻavae.O lenei auala e iloa ai e maualuga atu le lagona ma le faʻapitoa, ae o le faʻaogaina o le faʻaogaina e maualalo.E tasi le fa'aliliuga fa'aliliu e mafai ona na'o le tasi le miRNA ma se fa'amatalaga i totonu;o le siʻusiʻu-faʻaopoopo metotia e aofia ai le lua E faʻamaeʻaina i le gaioiga faʻatasi a lua enzymes, o le PolyA polymerase ma le faʻaliliuina o le transcriptase.O le PolyA polymerase e nafa ma le fa'aopoopoina o si'usi'u PolyA i le miRNA e fa'atele ai lona umi, ma fa'aliliuina le transcriptase fa'atino fa'aliliuga fa'aliliuga.O lenei metotia e maualuga le faʻaogaina ma e mafai ona iloa le tele o miRNA ma faʻamatalaga i totonu i le tasi faʻaliliuga faʻaliliu, ae o le lagona ma le faʻapitoa e maualalo i le auala-loop method.