Fluorescence quantitative PCR (lea e taʻua o TaqMan PCR, o loʻo taʻua mulimuli ane o le FQ-PCR) o se nucleic acid quantitative technology fou na atiaʻe e PE (Perkin Elmer) i le Iunaite Setete i le 1995. O lenei tekinolosi e faʻavae i luga o PCR masani e ala i le faʻaopoopoina o suʻega faʻailoga fluorescent.Pe a faatusatusa i le PCR fetuutuunai, FQ-PCR e tele mea lelei e iloa ai lona tele galuega.O lenei tusiga o loʻo faʻamoemoe e faʻamatala faʻapuupuu uiga, mataupu faavae, metotia, ma faʻaoga o tekinolosi.
1 Vaega
FQ-PCR e le gata o loʻo i ai le maualuga o le PCR masani, ae ona o le faʻaogaina o suʻesuʻega faʻafefe, e mafai ona iloa saʻo le suiga o le faailo o le fluorescent i le taimi o le PCR faʻalauteleina e ala i le faʻaogaina o le photoelectric e maua ai taunuuga faʻatusatusa, lea e manumalo ai i le tele o faaletonu o PCR masani, o lea e iai foi le maualuga maualuga o le faʻaogaina o le DNAcycycycytes ma le maualuga saʻo o le faʻaogaina o tekonolosi DNA.
Mo se faʻataʻitaʻiga, o oloa PCR lautele e manaʻomia ona mataʻituina e le agarose gel electrophoresis ma le ethidium bromide staining i le malamalama ultraviolet poʻo le polyacrylamide gel electrophoresis ma le faʻailoga siliva.O lenei mea e le gata e manaʻomia ai le tele o meafaigaluega, ae e manaʻomia ai foi le taimi ma taumafaiga.O pisia na fa'aaogaina Ethidium bromide e afaina i le tino o le tagata, ma o nei faiga fa'ata'ita'iga lavelave e maua ai avanoa mo le filogia ma fa'ailoga sese.Ae ui i lea, FQ-PCR e manaʻomia naʻo le tatalaina o le tapuni i le taimi o le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga, ma o le gaioiga mulimuli ane o le faʻaogaina atoa o le paipa, lea e le manaʻomia ai le PCR post-processing, aloese mai le tele o drawbacks i galuega masani PCR.O le fa'ata'ita'iga e masani ona fa'aogaina le ABI7100 PCR thermal cycler na fausia e le kamupani PE.
O le meafaigaluega o loʻo i ai uiga nei: ① Faʻaoga lautele: E mafai ona faʻaogaina mo le DNA ma le RNA PCR faʻatusatusaga o oloa, suʻesuʻega faʻamatalaga o gene, suʻesuʻeina o pathogen, ma le faʻaogaina o tulaga PCR.② Tulaga fa'atatau fa'atatau: Fa'aaogā su'esu'ega fa'aigoa fa'amalama, o le aofa'i o le fluorescence o le a fa'aputuina ma le PCR cycle pe a mae'a le fa'aosoina o le laser, ina ia ausia le fa'amoemoega o le fa'atusatusaina.③ Maua le galue maualuga: Fausia i totonu ole 9600 PCR uila vevela, komepiuta e pulea 1 i le 2 itula e faʻamaeʻa ai le faʻalauteleina ma le faʻatusatusaina o faʻataʻitaʻiga otometi ma faʻatasi.④ Leai se mea e manaʻomia mo gel electrophoresis: Leai se manaʻoga e faʻafefete ma faʻafefe le faʻataʻitaʻiga, naʻo le faʻaaogaina o se suʻesuʻega faʻapitoa e iloa saʻo i totonu o le tali.⑤Leai se filogia i totonu o le paipa: O le faʻaogaina atoatoa faʻapipiʻi faʻapipiʻiina ma le faʻaogaina o le photoelectric system o loʻo faʻaaogaina, o lea e leai se mea e popole ai i le filogia.⑥O fa'ai'uga e mafai ona toe fa'afo'iina: o le aofa'iga fa'atosina e o'o atu i le lima oka o le tele.O le mea lea, talu ai o lenei tekinolosi ua faʻaleleia lelei, ua faʻatauaina e le tele o suʻesuʻega faasaienisi ma ua faʻaaogaina i le tele o matata.
2 Mataupu Faavae ma metotia
O le ta'iala galue a le FQ-PCR o le fa'aogaina lea o le 5′→3′ exonuclease gaioioiga ole Taq enzyme e fa'aopoopo ai se su'esu'ega fa'ailoga fa'alelei ile PCR reaction system.O le su'esu'ega e mafai ona fa'afefiloi fa'atasi ma le fa'ata'ita'iga DNA o lo'o iai i le fa'asologa muamua.O le 5'i'uga o le su'esu'ega o lo'o fa'ailogaina i le fa'amalama fa'amalama FAM (6-carboxyfluorescein, fluorescence emission peak i le 518nm), ma le 3'end o lo'o fa'aigoaina i le O le fa'amalama fa'amalama vaega TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluorescence emission peak i le 582 fa'aoso i luga ole 582 fa'aosoina i le 582 fa'aoso fa'aosoina i le 5822 fa'aoso fa'aoso i le 5822 fa'aoso fa'aoso i le 5822 fa'aosoina i luga ole 5822. o le su'esu'ega mai le fa'alauteleina i le taimi o le fa'alauteleina o le PCR.A tumau pea le su'esu'ega, o le kulupu tineia e taofiofia le fa'aosoina o le fa'amalama o le vaega fa'amu.O le taimi lava e vavae ese ai le vaega emitting mai le vaega tineia, ua siitia le inhibition, ma o le optical density i le 518nm faateleina ma ua iloa e le fluorescence detection system.I le vaega toe faʻafouina, o le suʻesuʻega hybridizes ma le DNA mamanu, ma le Taq enzyme i le faʻaopoopoga vaega o loʻo faʻagasolo i luga o le mamanu DNA ma le faʻaopoopoga o le faʻavae.A tipi ese le su'esu'ega, e fa'amatu'u atu le aafiaga tineia ma fa'amatu'u ai le fa'ailo fa'alelei.Soo se taimi lava e kopi ai le mamanu, e tipi ese se suʻesuʻega, faʻatasi ma le faʻamatuʻuina o se faʻailoga faʻafefe.Talu ai o loʻo i ai se vaʻaiga tasi i le tasi i le va o le numera o fluorophores faʻamalolo ma le numera o oloa PCR, e mafai ona faʻaogaina lenei metotia e faʻamaonia saʻo ai le mamanu.Ole mea fa'ata'ita'i fa'ata'ita'iga e masani ona fa'aogaina le ABI7100 PCR thermal cycler na atia'e e le kamupani PE, ma e mafai fo'i ona fa'aogaina isi uila uila.Afai o le ABI7700 reaction type reaction system e fa'aogaina mo le fa'ata'ita'iga, pe a mae'a le tali, e mafai ona tu'u sa'o mai fa'ai'uga fa'atatau ile su'esu'ega komepiuta.Afai e te faʻaaogaina isi uila vevela, e manaʻomia lou faʻaogaina o se faʻamalama faʻamalama e fua ai le faailo o le fluorescence i totonu o le tali faʻafefe i le taimi e tasi e fuafua ai le RQ +, RQ-, △RQ.RQ + o loʻo faʻatusalia le fua faatatau o le faʻamalamalamaina o le faʻamalama o le vaega faʻafefe o le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga i le malosi o le faʻamalama o le kulupu tineia, RQ- o loʻo faʻatusalia le fua faatatau o le lua i totonu o le paipa avanoa, △RQ (△RQ = RQ + -RQ-) o loʻo faʻatusalia ai le aofaʻi o suiga o le faailo o le fluorescence i le taimi o le PCR A maeʻa le faʻatulagaina o faʻamatalaga e mafai ona quanti.Ona o le fa'aofiina o su'esu'ega fluorescent, o le fa'apitoa o le su'ega ua matua fa'aleleia.Ole mamanu su'esu'e e tatau ona fa'amalieina tulaga nei: ①O le umi ole su'esu'ega e tatau ona tusa ma le 20-40 fa'avae e fa'amautinoa ai le fa'apitoa ole fusifusia.②O mea o loʻo i lalo ole GC o loʻo i le va o le 40% ma le 60% e aloese ai mai le toe faʻaluaina o faʻasologa o nucleotide tasi.③ Aloese mai le tu'ufa'atasia po'o le fa'apipi'i i fa'amalama.④ O le mautu o le fusifusia i le va o le suʻega ma le faʻataʻitaʻiga e sili atu nai lo le mautu o le faʻamauina i le va o le faʻavae ma le faʻataʻitaʻiga, o le mea lea o le Tm tau o le suʻega e tatau ona le itiiti ifo i le 5 ° C le maualuga nai lo le Tm tau o le mea muamua.E le gata i lea, o le faʻaogaina o le suʻesuʻega, o le homology i le va o le suʻega ma le faʻasologa o faʻataʻitaʻiga, ma le mamao i le va o le suʻesuʻega ma le mea muamua e i ai uma se aafiaga i taunuuga faʻataʻitaʻiga.
oloa fa'atatau:
Saina Taimi Moni PCR Easyᵀᴹ-Taqman Gaosi ma Fa'atau |Foregene (foreivd.com)
Taimi meli: Oke-15-2021
