1. Malamalama fa'avae (afai e te mana'o e va'ai i le vaega fa'ata'ita'i, fa'amolemole tu'u sa'o ile vaega lona lua)

I le avea ai o se tali mai o le PCR masani, o le taimi moni o le PCR e mataʻituina le suiga o le aofaʻi o le faʻalauteleina o oloa i taʻamilosaga taʻitasi o le PCR faʻateleina tali i le taimi moni e ala i le suiga o le faailo o le fluorescence, ma suʻesuʻeina faʻatusatusa le mamanu amata e ala i le va o le ct tau ma le faʻasologa masani.

O faʻamatalaga patino o le RT-PCR olaina faavae, felafolafoaiga paepaemaCt tau.

Fa'ailoga masani mo le RT-PCR:

2. Laasaga faataitai

2.1 E uiga i le fa'avasegaga fa'ata'ita'iga- e tatau ona tele vaieli i totonu o le kulupu, ma e tatau ona i ai le toe faia o mea ola.

2.2 Fa'avae o le mamanu muamua

①SiRNA e faʻapitoa i ituaiga, ma o faʻasologa o ituaiga eseese o le a eseese.

②SiRNA o loʻo faʻapipiʻiina i le paʻu faʻamago faʻamago, lea e mafai ona teu lelei mo le 2-4 vaiaso i le vevela o le potu.

2.3 Meafaigaluega po'o reagents e mana'omia ona saunia muamua

2.4 E tusa ai ma mataupu e manaʻomia ona vaʻaia i laasaga faʻataʻitaʻi faʻapitoa:

①siRNA felauaiga faagasologa

1. Mo le faʻapipiʻiina, e mafai ona e filifilia le 24-well plate, 12-well plate poʻo le 6-well plate (o le averesi o le RNA faʻatulagaina o loʻo faʻatulagaina i totonu o vaieli taʻitasi o le 24-well plate e uiga i le 100-300 ng / uL), ma o le maualuga o le felauaiga sili ona lelei o sela e oʻo atu i le 60% -80% pe o lea.

2. O laasaga o felauaiga ma manaʻoga faʻapitoa e matuaʻi faʻatatau i faʻatonuga.

3. A maeʻa le felauaiga, e mafai ona aoina faʻataʻitaʻiga i totonu ole 24-72 itula mo le suʻesuʻeina o le mRNA (RT-PCR) poʻo le suʻesuʻeina o porotini i totonu ole 48-96 itula (WB)

② RNA fa'agasologa

1. Puipuia le faaleagaina e enzymes mai fafo.E masani lava ona aofia ai le ofuina o matapulepule ma totigilima;fa'aogaina o fa'amatalaga paipa fa'ama'i fa'ama'i ma paipa EP;o le vai e fa'aaogaina i le su'ega e tatau ona RNase-Free.

2. E fautuaina e fai faalua e pei ona fautuaina i le pusa faʻavave vave, lea o le a faʻaleleia atili ai le mama ma le fua.

3. E le tatau ona pa'i le suavai otaota ile koluma RNA.

③ RNA quantification

A maeʻa ona maua mai le RNA, e mafai ona faʻatusatusa saʻo ma Nanodrop, ma o le faitau maualalo e mafai ona maualalo e pei o le 10ng / ul.

④ Fa'aliliuga fa'asologa o tusitusiga

1. Ona o le maualuga o le maaleale o le RT-qPCR, e tatau ona faia ia le itiiti ifo i le 3 vaieli tutusa mo faʻataʻitaʻiga taʻitasi e puipuia ai le Ct mulimuli mai le ese tele poʻo le SD e tele tele mo suʻesuʻega fuainumera.

2. Aua le fa'a'aisa ma fa'asa'o fa'atasi le Master mix.

3. E tatau ona sui uma paipa/pu i se pito fou!Aua le fa'aauau ona fa'aoga le pito paipa e tasi e fa'aopoopo ai fa'ata'ita'iga!

4. O le ata tifaga faʻapipiʻi i le 96-well plate pe a uma ona faʻapipiʻi le faʻataʻitaʻiga e manaʻomia ona faʻamalo i se ipu.E sili le centrifuge a'o le'i tu'uina i luga o le masini, ina ia mafai ona tafe i lalo le vai i luga o le puipui o le paipa ma aveese ai le ea.

⑤A'ili'iliga masani pi'o

2.5 E uiga i su'esu'ega fa'amaumauga

Ole su'esu'ega o fa'amaumauga o le qPCR e mafai ona vaevaeina ile fa'atusatusaga fa'atatau ma le fa'atatauina atoatoa.Mo se faʻataʻitaʻiga, sela i totonu o le vaega o togafitiga faʻatusatusa i sela i totonu o le vaega e pulea,

E fa'afia ona suia le mRNA o le gene X, o le fa'atusatusaga lea;i se numera patino o sela, o le mRNA o le X gene

E fia kopi o lo'o i ai, o le fa'atatauina atoatoa lea.E masani lava o le mea e sili ona matou fa'aogaina i totonu o le falesu'esu'e o le fa'atusatusaga o metotia fa'atatau.E masani lava,le auala 2-ΔΔcte sili ona faʻaaogaina i faʻataʻitaʻiga, o lea naʻo lenei metotia o le a faʻaalia auiliili iinei.

2-ΔΔct metotia: O le iʻuga na maua o le eseesega i le faʻaaliga o le kenera taulaʻi i le vaega faʻataʻitaʻi e faʻatatau i le faʻasologa o le kenera i le vaega e pulea.E manaʻomia le faʻamalosia o le faʻaogaina o le kenera faʻatatau ma le kenera faʻasinomaga i totonu e latalata ile 100%, ma o le eseesega vavalalata e le tatau ona sili atu i le 5%.

Ole metotia fa'atatau e fa'apea:

Δct control group = ct tau o le kenera taulaʻi i le vaega pulea - ct tau o le kenera faasinomaga totonu i le vaega pulea

Δct vaega faʻataʻitaʻiga = ct tau o le kene faʻatatau i le vaega faʻataʻitaʻi - ct tau o le kene faʻasino i totonu i le vaega faʻataʻitaʻi

ΔΔct=Δct vaega faʻataʻitaʻi-Δct vaega faʻatonutonu

Ma le mea mulimuli, fuafua le tele o eseesega i le faʻaaliga tulaga:

Suia Gagana = 2-ΔΔct (e tutusa ma le galuega sili o le POWER)

oloa fa'atatau:

Cell Direct RT-qPCR pusa