Ⅰ. Fa'ateleina le ma'ale'ale o le faiga o tali:

1. Vaevae RNA maualuga:

O le fa'aogaina o le cDNA manuia e sau mai le RNA maualuga.O le RNA maualuga e tatau ona faʻamautinoa a itiiti ifo ma le umi le umi ma e le o iai ni inhibitors e le o iai ni enzymes puʻeina, pei ole EDTA poʻo le SDS.O le lelei o le RNA e fuafua ai le maualuga o le tau o faʻamatalaga faʻasologa e mafai ona e tusia i le cDNA.Ole auala fa'amama ole RNA ole auala ole fa'aogaina ole isocyanate/acidophenol.Ina ia puipuia le faʻaleagaina o le RNase, o le RNA e vavae ese mai se faʻataʻitaʻiga mauoa i le RNase (pei o le pancreas) e manaʻomia le teuina o formaldehyde e faʻasaoina ai le RNA maualuga, lea e sili atu mo le teuina umi.O le RNA na maua mai i le ate o le isumu na matua fa'aleagaina ina ua mae'a le vaiaso e tasi o le teuina i totonu o le vai, ae o le RNA na maua mai le iole o lo'o tumau pea ina ua mavae le tolu tausaga o teuina i le vai.E le gata i lea, o tusitusiga sili atu nai lo le 4kb e sili atu ona maaleale e suʻe le faʻaleagaina o le RNase nai lo faʻamaumauga laiti.Ina ia faʻateleina le mautu o le faʻataʻitaʻiga RNA teuina, e mafai ona faʻamavae le RNA i se methalmamine o le ion, ma teuina -70 °C.O le Thylide na fa'aaogaina e fa'asaoina ai le RNA e le tatau ona i ai se mea fa'apitoa e fa'aleagaina ai le RNA.RNA, lea e maua mai le pancreas, e mafai ona teuina i le methalmamine mo le itiiti ifo ma le tasi le tausaga.A e sauni e faʻaaoga le RNA, e mafai ona e faʻaogaina auala nei e faʻafefe ai le RNA: faʻaopoopo le NaCl i le 0.2m ma le 4 taimi le voluma o le ethanol, tuʻu le vevela o le potu mo le 3-5 minute, ma le 10,000 × g centrifugal mo le 5 minute.

2. Fa'aaoga le fa'aliliuga fa'aliliu e aunoa ma se gaoioiga RNaseH (RNaseH-):

RNase inhibitors e masani ona faʻaopoopoina e fesuiaʻi faʻaliliuga faʻaliliuga e faʻateleina ai le umi ma le gaosiga o le cDNA synthesis.O lo'o fa'aopoopoina le inhibitor RNase i le fa'asologa muamua o le fa'atupuina o le filifili i le i ai o pa'u ma fa'aitiitiga o mea e pei o le DTT ona o le fa'agasologa o le synthesis muamua o le cDNA e fa'aleagaina ai le inhibitor, ma fa'asa'oloto ai RNases e fa'aleagaina ai le RNA.O le inhibitor RNase protein e naʻo le taofia o le faʻaleagaina o le RNA e RNase A, B, C, ma e le taofia ai le RNases i luga o le paʻu, o lea e tatau ai ona faʻaeteete le faʻalauiloaina o RNases mai tamatamailima e ui lava i le faʻaogaina o nei inhibitors.

Reverse transcriptase e faʻamalosia le liua o le RNA i le cDNA.O le M-MLV ma le AMV o loʻo i ai le gaioiga RNaseH faʻaopoopoga i la latou lava gaioiga polymerase.O le gaioiga RNaseH e tauva ma gaioiga polymerase mo manoa heterozygous ua fausia i le va o RNA templates ma DNA primers poʻo le cDNA faʻalauteleina strands, ma faʻaleagaina RNA: RNA strands i DNA lavelave.O faʻataʻitaʻiga RNA ua faʻaleagaina e le RNaseH gaioiga e le mafai ona toe faʻaaogaina e fai ma mea aoga mo le faʻasologa o le cDNA, faʻaitiitia ai le gaosiga ma le umi o le faʻasologa o le cDNA.O le mea lea o le faʻaumatia poʻo le faʻaititia tele o le RNaseH gaioiga o le faʻaliliuina transcriptase o le a aoga tele.

SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase o RNaseH- ma le thermoScript reverse transcriptase, AMV o RNaseH- e sili atu le umi atoa cDNA nai lo MMLV ma AMV.O le ma'ale'ale o le RT-PCR e a'afia i le aofa'i o le cDNA fa'apipi'iina.ThermoScript e sili atu ona maaleale nai lo le AMV.Ole tele ole oloa RT-PCR e fa'atapula'aina ile mafai ole reverse transcriptase e fa'apipi'i le cDNA, ae maise pe a fa'apipi'i Cdnas tetele.Fa'atusatusa i le MMLV, SuperScripⅡ fa'ateleina le fa'atupuina o oloa umi RT-PCR.O le RNaseH-'s reverse transcriptase e faʻateleina ai foi le mautu o le vevela, o lea e mafai ai ona faia le tali i le vevela maualuga atu nai lo le masani o le 37-42 ℃.I lalo o tulaga fautuaina o le tuufaatasia, oligo(dT) primers ma le 10μCi [alpha-p]dCTP sa fa'aogaina.O le aofaʻiga o le gaosiga o le filifili muamua na faʻatatau i le faʻaogaina o le auala TCA.Na su'esu'eina le cDNA atoa i le fa'aogaina o le fa'avasegaina o le lapopo'a ma le faitauina i totonu o se gel agarose alkaline.

3. Fa'ateleina le vevela fa'asaoina o le vevela o fa'aliliuga fa'aliliu:

O le maualuga o le taofiofia o le vevela e fesoasoani e tatala ai le fausaga lona lua o le RNA ma faʻateleina le fua o le tali.Mo le tele o faʻataʻitaʻiga RNA, o le uuina o le RNA ma le primer i le 65°C e aunoa ma le paʻu poʻo le masima ona faʻamalieina vave lea i luga o le aisa e faʻaumatia ai le tele o fausaga lona lua ma faʻatagaina ai mea muamua e fusifusia.Ae ui i lea, o nisi faʻataʻitaʻiga o loʻo i ai pea le fausaga lona lua, e tusa lava pe ua maeʻa le vevela.O le fa'alauteleina o nei fa'ata'ita'iga faigata e mafai ona fa'atino i le fa'aaogaina o le ThermoScript reverse transcriptase ma le tu'uina o le fa'afoliga o le transcriptase i le vevela maualuga e fa'aleleia atili ai le fa'alauteleina.O le maualuga o le taofiofia o le vevela e mafai foi ona faʻateleina le faʻapitoa, aemaise lava pe a faʻaaogaina le cDNA synthesis e faʻaaoga ai gene-specific primers (GSPS) (silasila i le Mataupu 3).Afai e fa'aogaina le GSP, ia mautinoa o le Tm tau o le fa'avae e tutusa ma le vevela o lo'o fa'amoemoeina.Aua le fa'aogaina le oligo(dT) ma fa'ailoga fa'afuase'i i luga atu o le 60℃.E mana'omia ona fa'amauina fa'ailoga fa'afuase'i ile 25℃ mo le 10 minute a'o le'i fa'atuputeleina ile 60℃.I le faaopoopo atu i le faʻaaogaina o le maualuga o le vevela o tusitusiga, e mafai ona faʻaleleia le faʻapitoa e ala i le tuʻuina saʻo o le RNA / faʻafefiloi muamua mai le vevela denaturing 65 ℃ i le faʻaliliuga faʻasolosolo o loʻo taofiofia le vevela ma faʻaopoopoina se faʻafefiloi 2x faʻafefiloi muamua (cDNA thermal initiation synthesis).O lenei faiga e fesoasoani e puipuia ai le fa'atasiga fa'avae va'ava'ai e tupu i le vevela maualalo.O le fa'aogaina o se mea faigaluega PCR e fa'afaigofie ai le tele o suiga ole vevela e mana'omia mo le RT-PCR.

Tth vevela faʻamautu polymerase galue e pei o le DNA polymerase i luma o le Mg2+ ma le RNA polymerase i luma o le Mn2+.E mafai ona taofiofia le vevela ile 65℃.Ae ui i lea, o le i ai o le Mn2 + i le taimi o le PCR e faʻaitiitia ai le faʻamaoni, lea e faʻaitiitia ai le Tth polymerase mo le faʻalauteleina o le saʻo maualuga, e pei o le cDNA cloning.E le gata i lea, o le Tth e itiiti le lelei i le toe faʻaliliuina, lea e faʻaitiitia ai le lagona, ma talu ai e mafai e se enzyme e tasi ona faʻaalia le faʻaliliuina ma le PCR, e le mafai ona faʻaogaina faʻatonuga e aunoa ma se faʻaliliuga faʻaliliu e iloagofie ai oloa faʻateleina o le cDNA mai i latou o DNA genomic faʻaleagaina.

4. Fa'aopoopo e fa'aolaina ai fa'aliliuga fa'aliliu:

O le faʻaopoopoina o mea faʻaopoopo, e aofia ai le glycerin ma le DMSO, i le faʻasologa muamua o le faʻasologa o filifili e mafai ona faʻaititia ai le mautu o le nucleic acid double strand ma faʻamalolo le fausaga lona lua RNA.E oʻo atu i le 20% glycerin poʻo le 10% DMSO e mafai ona faʻaopoopo e aunoa ma le afaina o le gaioiga a SuperScriptⅡ poʻo MMLV.E mafai foʻi e le AMV ona faʻapalepale i le 20% glycerol e aunoa ma le faʻaitiitia o le gaioiga.Ina ia faʻateleina le maʻaleʻale o le RT-PCR i le SuperScriptⅡ reverse transcription reaction, 10% glycerol e mafai ona faʻaopopo ma faʻamama i le 45 ℃.Afai o le 1/10 o le retrotranscription-react product e faʻaopoopoina i le PCR, o le faʻaogaina o le glycerol i le faʻalauteleina o le tali e 0.4%, lea e le lava e taofia ai le PCR.

5. RNaseH faiga:

E mafai ona faʻaleleia le faʻalogona e ala i le togafitia o tali o le synthesis cDNA ma RNaseH aʻo leʻi faia le PCR.Mo nisi faʻataʻitaʻiga, e manatu o le RNA i le cDNA synthesis reaction e taofia ai le fusifusia o oloa faʻateleina, i le tulaga o le togafitiga RNaseH e mafai ona faʻateleina le lagona.E masani lava, o togafitiga RNaseH e mana'omia mo le fa'alauteleina o se fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga cDNA umi atoa, e pei o le tuberous scherosisⅡ e maualalo le kopi.Mo lenei faʻataʻitaʻiga faigata, RNaseH faʻaleleia le faʻailoga na gaosia e le cDNA faʻapipiʻiina e SuperScriptⅡ poʻo AMV.Mo le tele o tali a le RT-PCR, o le togafitiga RNaseH e filifili ona o le 95℃ insulated PCR denaturation laʻasaga e masani ona faʻafefeteina le RNA mai le RNA: DNA lavelave.

6. Fa'aleleia auala mo le su'eina o vaega laiti ole RNA:

O le RT-PCR e sili ona lu'itau pe a na'o ni vaega laiti ole RNA e maua.O le faʻaopoopoga o le glycogen e avea o se vaʻa i le taimi o le vavaeeseina o le RNA e fesoasoani e faʻateleina le fua o faʻataʻitaʻiga laiti.E mafai ona faʻaopoopoina le glycogen e leai se RNase i le taimi e tasi e pei o Trizol.Glycogen e solu vai ma e mafai ona tumau i le vai faʻatasi ma le RNA e fesoasoani i le timu mulimuli ane.Ole fa'atonuga ole RNase-free glycogen ole 250μg/ml mo fa'ata'ita'iga e itiiti ifo ile 50mg ole tino po'o 106 sela fa'aleaganu'u.

O le faʻaopoopoina o le acetylated BSA e faʻafefe ai faʻamatalaga faʻaliliuga e faʻaaoga ai le SuperScriptⅡ e mafai ona faʻateleina le lagona, ma mo le laʻititi o le RNA, faʻaitiitia le aofaʻi o le SuperScriptⅡ ma faʻaopoopo 40 iunite o le RnaseOut nuclease inhibitor e mafai ona faʻaleleia le maualuga o le iloa.Afai e fa'aogaina le glycogen ile RNA vavae'ese, ole fa'aopoopoina ole BSA po'o le RNase inhibitors e toe fa'afo'i fa'aliliuga fa'aliliuga e fa'aaoga ai le SuperScriptⅡ o lo'o fautuaina pea.

Ⅱ. Faʻateleina le faʻapitoa ole RT-PCR

1. fa'asologa o le cNDA:

E tolu auala eseese e mafai ona fa'aogaina e amata ai le fa'asologa muamua o le cDNA, ma o le tulaga fa'apitoa o metotia ta'itasi e a'afia ai le aofa'i ma le ituaiga cDNA fa'apipi'iina.

Ole auala fa'ata'ita'i fa'afuase'i ole faiga fa'apitoa ole tolu.E fa'apipi'i fa'ailoga i le tele o nofoaga i le tusitusiga atoa e maua ai le cDNA pu'upu'u, vaega umi.O lenei metotia e masani ona faʻaaogaina e maua ai le 5′ terminal sequences ma le cDNA mai RNA templates faʻatasi ai ma vaega faʻatulagaina lona lua poʻo faʻatasi ai ma nofoaga faʻamutaina e le mafai ona toe faia le transcriptase.Ina ia maua le cDNA sili ona umi, o le fua faatatau o primers i le RNA i faʻataʻitaʻiga RNA taʻitasi e manaʻomia ona fuafuaina faʻamalosi.O le fa'atonuga muamua o fa'asologa fa'afuase'i e amata mai i le 50 i le 250ng i le 20μl faiga fa'afoliga.Talu ai ona o le cDNA fa'apipi'iina mai le RNA atoa e fa'aaoga ai fa'asologa fa'afuase'i o le ribosomal RNA, o le poly(A)+RNA e masani ona filifilia e fai ma fa'ata'ita'iga.

Oligo(dT) amataga e sili atu ona ma'oti nai lo fa'asologa fa'afuase'i.E fa'afefiloi ma le si'usi'u poly(A) o lo'o maua i le pito 3' o le mRNA i le tele o sela eukaryotic.Talu ai o le poly(A)+RNA e tusa ma le 1% i le 2% o le RNA atoa, o le aofaʻi ma le lavelave o le cDNA e sili atu le laʻititi nai lo le faʻaaogaina o faʻamatalaga faʻafuaseʻi.Ona o lona tulaga fa'apitoa, oligo(dT) e masani lava e le mana'omia le fa'ata'ita'iga mo le RNA i le fua fa'atatau muamua ma le poly(A) + filifiliga.E fautuaina e faʻaaoga le 0.5μg oligo(dT) i le 20μl faʻaogaina faiga.oligo(dT)12-18 e talafeagai mo le tele o le RT-PCR.ThermoScript RT-PCR System e maua ai le oligo(dT)20 ona o lona mautu lelei o le vevela ma e talafeagai mo le maualuga o le taofiofia o le vevela.

Gene-specific primers (GSP) o faʻamatalaga faʻapitoa sili ona lelei mo le laʻasaga faʻasolosolo faʻasolosolo.O le GSP ose antisense oligonucleoside e mafai ona fa'afefiloi fa'atasi ma fa'asologa o taunu'uga RNA, nai lo le fa'amama uma o Rnas pei o fa'asologa fa'afuase'i po'o le oligo(dT).O tulafono na fa'aaogaina e mamanuina ai PCR primers e fa'atatau fo'i ile mamanu ole fa'aliliuga fa'aliliuga GSP.E mafai ona tutusa le fa'asologa o le GSP e pei o le fa'amaufa'ailoga fa'apipi'i i le pito o le mRNA3′, po'o le GSP e mafai ona mamanuina e fa'apipi'i i lalo ma le fa'asologa fa'asolosolo fa'asolosolo.Mo nisi mea fa'alautele, e mana'omia le fa'atulagaina o le sili atu ma le tasi le antisense primer mo le manuia o le RT-PCR ona o le fausaga lona lua o le RNA fa'amoemoe e ono taofia ai le fa'amata'u mai le fusia.O loʻo fautuaina e faʻaaoga le 1pmol antisense GSP i le faʻasologa muamua o le faʻaogaina o le 20μl.

2. Fa'ateleina le vevela fa'asaoina o le vevela o fa'aliliuga fa'aliliu:

Ina ia mafai ona faʻaoga atoatoa le faʻapitoa o le GSP, e tatau ona faʻaogaina le faʻaliliuga faʻasolosolo ma le mautu maualuga maualuga.E mafai ona fa'a'ese'ese le transcriptase fa'asaga i le vevela i le maualuga o le vevela e fa'ateleina ai le malosi o le tali.Mo se faʻataʻitaʻiga, afai e faʻapipiʻi le GSP i le 55°C, ona le faʻaaogaina atoatoa lea o le GSP pe a fai o le faʻaliliuga faʻaliliu e faia i le 37°C ma le faʻaitiitia o le malosi e faʻaaoga ai le AMV poʻo le M-MLV.Ae ui i lea, SuperScripⅡ ma ThermoScript e mafai ona tali i le 50 ℃ pe sili atu, lea e faʻaumatia ai oloa e le faʻapitoa e gaosia ile vevela maualalo.Mo le fa'amaoni maualuga, e mafai ona tu'u sa'o le fa'afefiloi o le RNA/premi mai le 65 ℃ denaturation vevela i le fa'aliliuga fa'asolo o lo'o taofia le vevela fa'atasi ai ma le fa'aopoopoina o se fa'afefiloi fa'afefiloi 2x fa'ato'a fa'ao'o (amuina le vevela o le cDNA synthesis).E fesoasoani lea e puipuia ai le fa'atasiga faavae i le va o mole mole i le vevela maualalo.O le fa'aaogaina o se mea faigaluega PCR e fa'afaigofie ai le tele o suiga ole vevela e mana'omia mo le RT-PCR.

3. Fa'aitiitia le fa'aleagaina o le DNA genomic:

O se tasi o fa'afitauli fa'aletonu ile RT-PCR ole RNA e fa'aleagaina le genomic DNA.O le faʻaaogaina o auala sili atu le vavaeeseina o le RNA, e pei o le Trizol Reagent, faʻaitiitia le faʻaleagaina o le DNA genomic i sauniuniga RNA.Ina ia aloese mai oloa na gaosia mai le genomic DNA, e mafai ona togafitia le RNA i le DnasⅠ faʻateleina e aveese ai le DNA faʻaleagaina aʻo leʻi toe fesuiaʻi tusitusiga.O faʻataʻitaʻiga na teuina i le 65 ℃ i le 2.0mM EDTA mo le 10 min e faʻagata ai le DNaseⅠ digestion.EDTA chelates magnesium ions e puipuia ai le magnesium ion faalagolago RNA hydrolysis e tupu i le vevela maualuga.

Ina ia mafai ona tuueseese le cDNA faʻamalosia mai le genome DNA amplification product, e mafai ona mamanuina faʻamaufaʻailoga e faʻapipiʻi ese ma le exon vavae ese.O oloa PCR e maua mai i le cDNA o le a pupuu nai lo mea e maua mai le DNA genomic ua afaina.O se fa'ata'ita'iga fa'atonutonu e aunoa ma se fa'aliliuga fa'aliliu e faia fo'i i fa'ata'ita'iga RNA ta'itasi e iloa ai pe o se vaega tu'ufa'atasi e mai le genomic DNA po'o le cDNA.O oloa PCR e maua i le leai o se fa'aliliuga fa'aliliu e maua mai le genome.

Oloa Fa'atatau

RT-PCR Faigofie^ᵀᴹI(Laasaga Tasi)

-O le pusa e tasi-laasaga e mafai ai ona faʻafeiloaʻi faʻaliliuga ma PCR e faʻatinoina i totonu o le paipa tutusa.E mana'omia na'o le fa'aopoopoina o le RNA fa'ata'ita'iga, fa'ailoga PCR fa'apitoa ma le RNase-Free ddH₂O.

-Taimi moni su'esu'ega fa'atusa o le RNA e mafai ona fa'atinoina vave ma sa'o.

-O lo'o fa'aogaina e le pusa se mea fa'apitoa fa'aliliuga fa'aliliuga a Foregene ma Foregene HotStar Taq DNA Polymerase tu'ufa'atasia ma se faiga fa'aalia uiga ese e fa'aleleia atili ai le fa'asili ma le fa'apitoa o le tali.

-O le faiga tali sili ona lelei e faia ai le tali e maua ai le maualuga o le iloa, sili atu le malosi o le vevela, ma sili atu le faapalepale.

RT Easy II(Fa'atasi ai ma le GDNase) Master Premix Mo First-Strand CDNA Synthesis Mo Taimi Moni PCR ma le GDNase

- Lelei le gafatia e aveese le gDNA, lea e mafai ona aveese le gDNA i le mamanu i totonu ole 2 minute.

- Faiga fa'aliliuga lelei, e na'o le 15 minute e fa'amae'a ai le tu'ufa'atasiga o le strand cDNA muamua.

- Faʻataʻitaʻiga lavelave: faʻataʻitaʻiga e maualuga le GC ma mea faʻapitoa lona lua e mafai foi ona toe fesuiaʻi ma le maualuga maualuga.

-Faiga fa'aliliuga fa'aliliuga maualuga, fa'ata'ita'iga pg-level e mafai fo'i ona maua le cDNA maualuga.

-O le faʻasologa faʻaliliuga faʻaliliuga e maualuga le mautu o le vevela, o le vevela sili ona lelei o le 42 ℃, ma o loʻo i ai pea le lelei o le faʻaliliuina o le faʻasologa i le 50 ℃.