一, Fa'ateleina le maaleale o le faiga tali:

1. Fa'amavae le RNA maualuga:

O le fa'asologa o le cDNA manuia e sau mai le RNA maualuga.O le RNA maualuga e tatau ona le itiiti ifo i le umi atoa ma e leai ni fa'ainitaneti transcriptase fa'aliliu e pei ole EDTA po'o le SDS.O le lelei o le RNA e fuafua ai le aofaʻi maualuga o faʻamatalaga faʻasologa e mafai ona e faʻaliliuina i le cDNA.Ole auala masani ole fa'amamaina ole RNA ole auala e tasi le la'asaga e fa'aaoga ai le guanidine isothiocyanate/acid phenol.Ina ia puipuia le faʻaleagaina e ala ile tele ole RNase, ole RNA e vavae ese mai faʻataʻitaʻiga o le RNase-oaoa (pei o le pancreas) e manaʻomia ona teuina ile formaldehyde e faʻasaoina ai le RNA maualuga, aemaise lava mo le teuina umi.O le RNA na maua mai i le ate o isumu na matua fa'aleagaina ina ua uma ona teuina i totonu o le vai mo le vaiaso e tasi, ae o le RNA na maua mai le iole o lo'o tumau pea ina ua uma ona teuina i totonu o le vai mo le 3 tausaga.E le gata i lea, o tusitusiga umi atu nai lo le 4 kb e sili atu ona maaleale i le faʻaleagaina e ala i le faʻasologa o RNases nai lo faʻamaumauga laiti.Ina ia faʻateleina le mautu o faʻataʻitaʻiga RNA teuina, RNA e mafai ona faʻamavaeina i le deionized formamide ma teuina ile -70°C.Formamide na fa'aaogaina e fa'asaoina ai le RNA e tatau ona sa'oloto mai otaota fa'aleagaina RNA.RNA mai le pancreas e mafai ona faʻasaoina ile formamide mo le itiiti ifo ma le tasi le tausaga.A e sauni e faʻaaoga le RNA, e mafai ona e faʻaogaina le auala lenei e faʻafefe ai le RNA: faʻaopoopo le NaCl i le 0.2M ma le 4 taimi le tele o le ethanol, tuʻu i le vevela o le potu mo le 3-5 minute, ma le centrifuge i le 10,000 × g mo le 5 minute.

2. Fa'aaoga le RNaseH-inactive (RNaseH-) reverse transcriptase:

RNase inhibitors e masani ona faʻaopoopoina e fesuiaʻi faʻaliliuga faʻaliliuga e faʻateleina ai le umi ma le gaosiga o le cDNA synthesis.RNase inhibitors e tatau ona faʻaopoopo i le taimi muamua-strand synthesis tali i le i ai o se paʻu ma se faʻaitiitiga sui (e pei o le DTT), ona o le faagasologa ao leʻi faia le cDNA synthesis e faʻaumatia ai le inhibitor, ma faʻasaʻoloto ai le RNase e mafai ona faʻaleagaina le RNA.Polotini RNase inhibitors naʻo le puipuia o le faʻaleagaina o le RNA e RNase A, B, C, ma aua le taofia le RNase i luga o le paʻu, o lea ia faʻaeteete ia aua neʻi faʻafeiloaʻi le RNase mai ou tamatamailima e ui lava i le faʻaogaina o nei inhibitors.

Reverse transcriptase e faʻamalosia le liua o le RNA i le cDNA.O le M-MLV ma le AMV o loʻo i ai le gaioiga RNaseH faʻaopoopoga i la latou lava gaioiga polymerase.O le gaioiga a le RNaseH ma le gaioiga polymerase e tauva le tasi ma le isi mo le fusi o le RNA ua fausia i le va o le RNA template ma le DNA primer po'o le cDNA fa'alautele strand, ma fa'aleagaina le RNA strand i le RNA: DNA lavelave.O le faʻataʻitaʻiga RNA faʻaleagaina e le RNaseH gaioiga e le mafai ona toe avea o se mea aoga mo le cDNA synthesis, lea e faʻaitiitia ai le gaosiga ma le umi o le cDNA synthesis.O le mea lea, o le a aoga le faʻaumatia pe faʻaititia tele le gaioiga RNaseH o le faʻaliliuina transcriptase.

SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV reverse transcriptase ma thermoScript reverse transcriptase, RNaseH-AMV, e mafai ona maua le tele ma sili atu le umi atoa cDNA nai lo MMLV ma AMV.O le ma'ale'ale o le RT-PCR o le a a'afia ile aofa'i ole fa'asologa o le cDNA.ThermoScript e sili atu ona maaleale nai lo le AMV.Ole tele ole oloa RT-PCR e fa'atapula'aina ile mafai ole reverse transcriptase e fa'apipi'i le cDNA, ae maise pe a fa'apipi'i cDNA tetele.Fa'atusatusa i le MMLV, SuperScripⅡ fa'ateleina le fa'atupuina o oloa umi RT-PCR.O le RNaseH-reverse transcriptase ua faʻateleina foʻi le thermostability, o lea o le tali e mafai ona faia i le vevela maualuga atu nai lo le masani 37-42 ° C.I lalo o le fa'atonuga o tu'uga fa'aopoopo, fa'aaoga le oligo(dT) primer ma le 10 μCi o le [α-P]dCTP.Ole aofa'iga o fua ole la'au muamua na fa'atatau ile fa'aogaina ole TCA.Na su'esu'eina le cDNA atoa i le fa'aogaina o fusi fa'avasega lapopo'a ua tipi ese ma faitau i luga ole gel agarose alkaline.

3. Si'itia le vevela o le incubation mo le fa'aliliuina o tusitusiga:

O le maualuga o le vevela o le incubation e fesoasoani e tatala ai le fausaga lona lua o le RNA, faʻateleina le fua o le tali.Mo le tele o faʻataʻitaʻiga RNA, faʻapipiʻi le RNA ma primers i le 65°C e aunoa ma le paʻu poʻo le masima, sosoo ai ma le faʻafefe vave i luga o le aisa o le a faʻaumatia ai le tele o fausaga lona lua ma faʻatagaina ai mea muamua e fusifusia.Ae ui i lea, o nisi faʻataʻitaʻiga o loʻo i ai pea fausaga lona lua, tusa lava pe a maeʻa le vevela.O le fa'alauteleina o nei fa'ata'ita'iga faigata e mafai ona fa'atino e fa'aaoga ai le ThermoScript Reverse Transcriptase ma tu'u le fa'aliliuga fa'aliliuga fa'asolo i se vevela maualuga e fa'aleleia atili ai le fa'alauteleina.O le maualuga o le vevela o le incubation e mafai foi ona faʻateleina le faʻapitoa, aemaise lava pe a faʻaaogaina gene-specific primers (GSP) mo le cDNA synthesis (silasila i le Mataupu 3).Afai e fa'aogaina le GSP, ia mautinoa o le Tm o mea muamua e tutusa ma le vevela o lo'o fa'amoemoeina.Aua le fa'aogaina le oligo(dT) ma fa'amatamata fa'afuase'i i luga atu o le 60°C.E mana'omia le fa'atupu fa'ato'a ile 25°C mo le 10 minute a'o le'i si'itia ile 60°C.I le faʻaopoopoga i le faʻaaogaina o le maualuga o le vevela o le faʻaliliuga, e mafai foi ona faʻaleleia le faʻapitoa e ala i le tuʻuina saʻo o le RNA / faʻafefiloi muamua mai le vevela o le denaturation o le 65 ° C i le faʻafefe o le vevela o le transcription ma faʻaopoopoina se faʻafefiloi faʻafefiloi 2x muamua (cDNA vevela-start synthesis) .O lenei faiga e fesoasoani e puipuia ai le fa'atasiga fa'avae va'ava'ai e tupu i le vevela maualalo.Ole tele ole suiga ole vevela e mana'omia mo le RT-PCR e mafai ona fa'afaigofie ile fa'aogaina ole uila afi.

Tth thermostable polymerase galue o se DNA polymerase i luma o Mg2+ ma o se RNA polymerase i luma o le Mn2+.E mafai ona fa'amafanafanaina ile maualuga ole vevela ole 65°C.Ae ui i lea, o le i ai o le Mn2 + i le taimi o le PCR e faʻaitiitia ai le faʻamaoni, lea e faʻaitiitia ai le Tth polymerase mo le faʻalauteleina o le saʻo maualuga, e pei o le faʻaogaina o le cDNA.E le gata i lea, o le Tth e maualalo le lelei o le faʻaliliuina, lea e faʻaitiitia ai le maaleale, ma, talu ai e mafai ona faia le faʻaliliuga faʻaliliu ma le PCR i se enzyme e tasi, e le mafai ona faʻaogaina faʻatonuga e aunoa ma se faʻaliliuga faʻaliliu e faʻatusatusa ai oloa faʻalauteleina o le cDNA ma faʻaleagaina genomic DNA.O mea fa'apipi'i sa tu'ueseeseina.

4. Fa'aopoopo e fa'alauiloa ai le fa'aliliuina o tusitusiga:

O mea fa'aopoopo e aofia ai le glycerol ma le DMSO o lo'o fa'aopoopoina i le fa'asologa o le synthesis muamua, lea e mafai ona fa'aitiitia ai le mautu o le nucleic acid double-strand ma tatala le fausaga lona lua o le RNA.E oʻo atu i le 20% glycerol poʻo le 10% DMSO e mafai ona faʻaopoopo e aunoa ma le afaina o le SuperScript II poʻo le MMLV gaioiga.E mafai fo'i e le AMV ona fa'apalepale i le 20% glycerol e aunoa ma le leiloa o se gaioiga.Ina ia faʻateleina le maʻaleʻale o le RT-PCR i le SuperScriptⅡ reverse transcription reaction, 10% glycerol e mafai ona faʻaopoopo ma faʻafefe i le 45°C.Afai o le 1/10 o le faʻaliliuga faʻaliliuga faʻaliliuga faʻaopoopo e faʻaopoopo i le PCR, o le faʻaogaina o le glycerol i le faʻalauteleina o le tali e 0.4%, lea e le lava e taofia ai le PCR.

5. RNaseH togafiti:

Togafitiga o tali fa'atusa o le cDNA ma le RNaseH a'o le'i faia le PCR e mafai ona fa'atuputeleina le ma'ale'ale.Mo nisi faʻataʻitaʻiga, e manatu o le RNA i le cDNA synthesis reaction e taofia ai le fusifusia o oloa faʻalauteleina, lea e mafai ai e le togafitiga RNaseH ona faʻateleina le lagona.E masani lava, e mana'omia le togafitiga RNaseH pe a fa'atuputeleina fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga cDNA umi-umi, e pei o le low-copy tuberous scherosis II.Mo lenei faʻataʻitaʻiga faigata, RNaseH togafitiga faʻaleleia le faʻailoga na gaosia e le SuperScript II poʻo le AMV-synthesized cDNA.Mo le tele o tali a le RT-PCR, o le togafitiga RNaseH e filifili, aua o le la'asaga o le denaturation PCR i le 95 ° C e masani ona fa'afefeteina le RNA i le RNA: DNA lavelave.

6. Fa'aleleia o le Laiti RNA Su'esu'ega Metotia:

O le RT-PCR e sili ona lu'itau pe a na'o ni vaega laiti ole RNA e maua.Glycogen faʻaopoopo e fai ma ave i le taimi o le vavaeeseina o le RNA e fesoasoani e faʻateleina le fua o faʻataʻitaʻiga laiti.E mafai ona faʻaopoopo le glycogen e leai se RNase i le taimi e tasi e faʻaopoopo ai le Trizol.Glycogen e solu vai ma e mafai ona teuina i le vaega vai ma le RNA e fesoasoani i le timu mulimuli ane.Mo faʻataʻitaʻiga e itiiti ifo i le 50 mg o meaʻai poʻo 106 sela faʻaleaganuʻu, o le faʻatonuga fautuaina o le glycogen e leai se RNase e 250 μg/ml.

O le faʻaopoopoina o le BSA acetylated i le faʻaliliuga faʻaliliuga faʻafefeteina e faʻaaoga ai le SuperScript II e mafai ona faʻateleina le maaleale, ma mo le itiiti ifo o le RNA, faʻaitiitia le aofaʻi o SuperScript II ma faʻaopoopo 40 iunite o le RNaseOut nuclease inhibitor e mafai ona faʻateleina le maualuga o le iloa.Afai e faʻaaogaina le glycogen i le faʻagasologa o le vavae ese o le RNA, e fautuaina pea e faʻaopoopo le BSA poʻo le RNase inhibitor pe a faʻaaogaina le SuperScript II mo le faʻaliliuina o le faʻaliliuga.

二, Fa'ateleina le fa'apitoa o le RT-PCR

1. CND Asynthesis:

E mafai ona amataina le fa'asologa muamua o le cDNA i le fa'aogaina o auala eseese e tolu, o le fa'apitoa fa'apitoa e a'afia ai le aofa'i ma le ituaiga o cDNA fa'apipi'iina.

O le auala fa'ata'ita'i fa'afuase'i o le fa'atauva'a fa'apitoa o metotia e tolu.E fa'apipi'i fa'amau i le tele o nofoaga i totonu o le tusitusiga, fa'atupuina pu'upu'u, vaega-umi cDNAs.O lenei metotia e masani ona faʻaaogaina e maua ai le 5′ faʻasologa faʻaiʻuga ma ia maua mai le cDNA mai RNA faʻataʻitaʻiga ma itulagi o le fausaga lona lua poʻo faʻatasi ai ma nofoaga faʻamutaina e le mafai ona toe faʻaaogaina e le transcriptase reverse.Ina ia maua le cDNA sili ona umi, o le fua faatatau o primers i le RNA i faʻataʻitaʻiga RNA taʻitasi e manaʻomia ona fuafuaina faʻamalosi.O le fa'atonuga amata o fa'asologa fa'afuase'i e amata mai i le 50 i le 250 ng i le 20 μl tali.Talu ai o le cDNA fa'apipi'iina mai le RNA atoa e fa'aaoga ai fa'asologa fa'afuase'i o le ribosomal RNA, o le poly(A)+RNA e masani ona filifilia e fai ma fa'ata'ita'iga.

Oligo(dT) primers e sili atu ona ma'oti nai lo fa'asologa fa'afuase'i.E fa'afefiloi i le si'usi'u poly(A) o lo'o maua i le pito 3' o le tele o mRNA eukaryotic.Ona o le poly(A) + RNA e tusa ma le 1% i le 2% o le RNA atoa, o le aofaʻi ma le lavelave o le cDNA e itiiti ifo nai lo faʻasologa faʻasolosolo.Ona o lona tulaga faʻapitoa, oligo(dT) e masani lava e le manaʻomia le faʻamautuina o le fua faatatau o le RNA i faʻamuamua ma le poly(A) + filifiliga.E fautuaina e faʻaaoga le 0.5μg oligo(dT) i le 20μl faʻaogaina faiga.oligo(dT)12-18 e talafeagai mo le tele o le RT-PCR.O le ThermoScript RT-PCR System e ofoina atu le oligo(dT)20 ona o lona mautu fa'amama lelei mo le maualuga o le vevela.

Gene specific primers (GSP) o fa'amatalaga sili ona ma'oti mo le la'asaga fa'aliliu fa'asaga.O le GSP o se oligonucleotide antisense lea e mafai ona fa'apipi'i fa'atasi i le fa'asologa o fa'asologa o le RNA, e le pei o fa'asologa fa'afuase'i po'o le oligo(dT), lea e fa'apipi'i i RNA uma.O tulafono lava e tasi na fa'aaogaina e mamanu ai PCR primers e fa'aoga i le mamanu o le GSP i fa'aliliuga fa'aliliuga.O le GSP e mafai ona tutusa le fa'asologa e pei o le fa'aliga muamua lea e fa'apipi'i i le 3'-tele pito o le mRNA, po'o le GSP e mafai ona mamanuina e fa'amau i lalo o le fa'asolosolo fa'asolosolo fa'asolosolo.Mo nisi mataupu fa'alautele, e sili atu ma le tasi le antisense primer e mana'omia ona mamanuina mo le manuia o le RT-PCR ona o le fausaga lona lua o le RNA fa'amoemoe e ono taofia ai le fusia muamua.E fautuaina e fa'aaoga le 1 pmol antisense GSP i le 20 μl first-strand synthesis reaction.

2. Si'itia le vevela o le incubation mo le toe fa'aliliuga:

Ina ia mafai ona faʻaogaina atoatoa le faʻaogaina atoatoa o le GSP faʻapitoa, e tatau ona faʻaogaina se faʻaliliuga faʻatasi ma le maualuga maualuga o le thermostability.Thermotable reverse transcriptases e mafai ona incubate i le maualuga o le vevela e faʻateleina ai le saʻo o tali.Mo se fa'ata'ita'iga, afai e fa'amauina se GSP i le 55°C, o le a le fa'aogaina atoatoa le fa'apitoa o le GSP pe a fa'aogaina le AMV po'o le M-MLV mo le fa'aliliuina o le fa'aliliuga i le fa'amaualalo o le 37°C.Ae ui i lea, SuperScript II ma ThermoScript e mafai ona tali atu ile 50°C pe sili atu, lea o le a faʻaumatia ai mea e le faʻapitoa e gaosia ile vevela maualalo.Mo le fa'amaoni maualuga, e mafai ona tu'u sa'o le fa'afefiloi RNA/primer mai le vevela denaturation o le 65°C i le vevela fa'asolosolo fa'aliliuga ma fa'aopoopo i se fa'afefiloi 2x fa'afefiloi muamua (cDNA synthesis hot start).E fesoasoani lea e puipuia ai le fa'apipi'iina o fa'avae mole mole i le vevela maualalo.Ole tele ole suiga ole vevela e mana'omia mo le RT-PCR e mafai ona fa'afaigofie ile fa'aogaina ole uila afi.

3. Fa'aitiitia le fa'aleagaina o le genomic DNA:

O se fa'afitauli fa'alavelave e feagai ma le RT-PCR o le fa'aleagaina lea o le DNA genomic i le RNA.O le faʻaaogaina o se auala faʻaesea RNA lelei, e pei o le Trizol Reagent, o le a faʻaitiitia ai le aofaʻi o DNA genomic e faʻaleagaina ai le sauniuniga RNA.Ina ia aloese mai oloa e maua mai le genomic DNA, RNA e mafai ona togafitia i le amplification-grade DNase I e aveese ai le DNA faʻaleagaina aʻo leʻi toe fesuiaʻi tusitusiga.O le DNase I digestion na faʻamutaina e ala i le faʻapipiʻiina o faʻataʻitaʻiga i le 2.0 mM EDTA mo le 10 minute i le 65 ° C.E mafai e le EDTA ona faʻafefe ion magnesium, puipuia le faʻaogaina o le RNA faʻalagolago i le magnesium i le vevela maualuga.

Ina ia mafai ona tuueseese le cDNA faʻamalosia mai le faʻaleagaina o le genomic DNA amplification products, e mafai ona mamanuina faʻamaufaʻailoga taʻitasi e tuʻu eseese ai exons.O oloa PCR e maua mai i le cDNA o le a pupuu nai lo mea e maua mai le DNA genomic ua afaina.E le gata i lea, o se faʻataʻitaʻiga faʻatonutonu e aunoa ma se faʻaliliuga faʻaliliu na faia i luga o faʻataʻitaʻiga RNA taʻitasi e iloa ai pe o se fasi vaega na maua mai le genomic DNA poʻo le cDNA.O le oloa PCR e maua e aunoa ma se fa'aliliuga fa'aliliu e maua mai i le genome.