RT-qPCR e atiaʻe mai tekinolosi PCR masani.E fa'aopoopoina vaila'au fa'amalama (lanu felanulanua'i po'o su'esu'ega fa'afoma'i) i le faiga masani o le PCR reaction system, ma iloa ai le PCR annealing ma fa'aopoopoga fa'agasologa i le taimi moni e tusa ai ma a latou faiga fa'amalamalama eseese.O suiga fa'ailo fa'alelei i le alalaupapa e fa'aaogaina e fuafua ai le aofa'i o suiga o oloa i ta'amilosaga ta'itasi o le PCR.I le taimi nei, o auala sili ona taatele o le fluorescent dye method ma le su'esu'ega.

Metotia lanu felanulanua'i:
O nisi o lanu felanulanua'i, e pei ole SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ma isi, e le fa'amalama na'o latou lava, ae fa'auluina le felanulanua'i pe a uma ona fusifusia i le tootoo la'ititi o le dsDNA.O le mea lea, i le amataga o le PCR tali, e le mafai e le masini ona iloa le faailo o le fluorescent.A oʻo atu le tali i le faʻapipiʻi-faʻaopoopoga (lua-laasaga auala) poʻo le faʻalauteleina o laʻasaga (tolu-laasaga auala), o le faʻaulu faʻalua e tatalaina i le taimi lea, ma le DNA polymerase fou I le taimi o le faʻapipiʻiina o fusi, e tuʻufaʻatasia mole o le fluorescent i le dsDNA laʻititi laʻititi ma emit fluorescence.A'o fa'atupula'ia le aofa'i o ta'amilosaga o le PCR, e fa'aopoopo le tele o vali fa'atasi ma le dsDNA, ma fa'aauau pea ona fa'aleleia le fa'ailo o le fluorescent.Ave le SYBR Green Ⅰ e fai ma fa'ata'ita'iga.
Metotia su'esu'e:
Ole su'esu'ega Taqman ole su'esu'ega fa'asusu e sili ona fa'aaogaina.O lo'o i ai se vaega fa'alelei i le pito 5' ole su'esu'ega, e masani lava FAM.O le su'esu'ega lava ia o se fa'asologa e fa'aopoopo i le kenera fa'atatau.O lo'o i ai se vaega fa'afefeteina i le pito 3' o le fluorophore.E tusa ai ma le mataupu faavae o le fluorescence resonance fesiitaiga malosi (Förster resonance energy transfer, FRET), pe a le fai lipoti fluorescent vaega (donor fluorescent mole) ma le tineia fluorescent vaega (acceptor fluorescent mole) Pe a felafoaʻi alaleo excitation ma le mamao e matua latalata (7-10nm), o le excitation o le autofluorescent molecule e mafai ona i totonu o le vaivai o le foaʻi. ned.O le mea lea, i le amataga o le PCR tali, pe a leai se su'esu'ega ma atoatoa i totonu o le faiga, o le a le fa'aosoina e le vaega fa'amalama talatala.A mae'a, e fusifusia le mea muamua ma le su'ega i le mamanu.I le taimi o le faʻaopoopoga, o le polymerase faʻaauau ona faʻapipiʻi filifili fou.O le DNA polymerase e iai le 5′-3′ exonuclease gaioiga.A o'o atu i le su'esu'ega, o le DNA polymerase o le a fa'a-hydrolyse le su'esu'ega mai le fa'ata'ita'iga, tu'u'ese'ese le vaega fa'amalama fa'asalalau mai le vaega fa'amalama fa'amae'a, ma fa'amatu'u le fa'ailo fa'amalama.Talu ai o loʻo i ai se vaʻaiga tasi-i-tasi i le va o le suʻega ma le faʻataʻitaʻiga, o le auala suʻesuʻe e sili atu nai lo le auala vali i tulaga o le saʻo ma le maaleale o le suʻega.

Ata 1 Fa'avae ole qRT-PCR

Fuafuaga muamua
Fa'avae:

E tatau ona fa'ata'atia ia fa'amatamata i le vaega fa'asao o le fa'asologa o le nucleic acid ma fa'apitoa.

E sili ona lelei le faʻaogaina o le cDNA sequence, ma le mRNA sequence e talia foi.Afai e leai, su'e le cds region design o le DNA sequence.
Le umi o le fluorescent quantitative oloa o le 80-150bp, o le umi o le 300bp, o le umi muamua e masani lava i le va o 17-25 faavae, ma le eseesega i le va o le pito i luga ma lalo primers e le tatau ona tele tele.

Ole mea ole G+C ole va ole 40% ma le 60%, ma le 45-55% ole sili.
Ole tau ole TM ile va ole 58-62 tikeri.
Taumafai e aloese mai le dimers muamua ma le tagata lava-dimers, (e le sili atu i le 4 pea o faavae lagolago sosoo) fausaga lauulu, pe a le mafai ona alofia, fai ΔG<4.5kJ/mol* Afai e le mafai ona e mautinoa ua aveesea le gDNA i le taimi o le liliuina transcription mama, e sili ona mamanuina le primers o le intron * 3′ pito e le mafai ona suia AT, GC2 ma le mauoa faʻaiʻuga e le mafai ona faʻaleleia, GC2 / faʻauʻuga faʻaauau, AT, GC2 ma le faʻaogaina. ) fa'amuamua ma le leai
patino O le homology o le fa'asologa fa'aopoopo fa'afetetele e sili ona itiiti ifo i le 70% po'o e 8 fa'atasi fa'avae fa'atasi.
Fa'amaumauga:
CottonFGD su'esu'e i upu autu
Fuafuaga muamua:
IDT-qPCR mamanu muamua

Fig2 IDT i luga ole laiga i luga ole laiga itulau meafaigaluega mamanu

Ata 3 fa'aaliga itulau i'uga
Fuafuaga o lncRNA primers:
lncRNA:laasaga tutusa e pei o le mRNA.
miRNA:O le mataupu faavae o le auala-loop method: Talu ai o miRNA uma o ni fa'asologa pupuu e tusa ma le 23 nt, e le mafai ona faia sa'o PCR su'esu'ega, o lea e fa'aoga ai le meafaigaluega fa'asologa o le stem-loop.O le fa'asologa o le fa'asologa o le fa'asologa o se DNA e tasi le manoa e tusa ma le 50 nt, lea e mafai ona fausia ai se fausaga fa'apipi'i na'o ia.3 'O le iuga e mafai ona mamanuina e avea o se faʻasologa faʻatasi i le vaega vaega miRNA, ona mafai lea ona faʻafesoʻotaʻi le miRNA sini i le faʻasologa faʻasolosolo i le taimi o le faʻaliliuga, ma o le umi atoa e mafai ona oʻo atu i le 70bp, lea e ogatasi ma le umi o le oloa faʻateleina fuafuaina e le qPCR.Fa'ailoga muamua o le miRNA.
Fa'aliga-fa'apitoa su'esu'ega:
Fa'amaumauga tu'uaiga i luga ole laiga: CottonFGD blast e ala ile fa'asologa tutusa
Fa'alotoifale: Va'ai i le fa'aogaina o le Blast + e fai ai le fa'apitonu'u, linux ma macos e mafai ona fa'atuina sa'o se fa'amaumauga fa'apitonu'u, e mafai fo'i ona fai le faiga o le win10 pe a uma ona tu'u le ubuntu bash.Fausia fa'amaumauga tu'uaiga fa'apitonu'u ma pa fa'apitonu'u;tatala le ubuntu bash ile win10.
Matauina: O le cotton i luga ma le sea island cotton o fuala'au tetraploid, o le taunuuga o le pa e masani ona lua pe sili atu afitusi.I aso ua tuanaʻi, o le faʻaaogaina o le NAU cds e fai ma faʻamaumauga e faʻatino ai le paʻu e foliga mai e maua ai ni kenera tutusa e lua ma na o ni nai eseesega SNP.E masani lava, o genes e lua e le mafai ona tu'u'ese'esea e ala i le mamanu muamua, o lea e fa'atatauina tutusa.Afai o loʻo i ai se indel manino, e masani lava ona mamanuina le faʻavae i luga o le indel, ae e mafai ona oʻo atu ai i le fausaga lona lua o le faʻavae O le malosi saoloto e maualuga atu, e oʻo atu ai i le faʻaitiitia o le faʻaogaina o le faʻaleleia, ae e le mafai ona alofia.

Su'esu'ega o le fausaga lona lua muamua:
Laasaga:tatala oligo 7 → faʻasologa faʻasologa faʻapipiʻi → tapuni lalo-faʻamalama → faʻasao → suʻe primer i luga o le faʻataʻitaʻiga, fetaomi ctrl+D e seti le umi muamua → iloilo eseese fausaga lona lua, e pei o le tino-dimerization tino, heterodimer, hairpin, mismatch, ma isi.O le taunuuga o le pito i luma e lelei, e leai se dimer manino ma hairpin fausaga, e leai ni faavae lagolago faifaipea, ma o le taua atoatoa o le malosi saoloto e itiiti ifo i le 4.5, ae o le pito i tua o loʻo faʻaalia ai le faʻaauau O faavae 6 e faʻaopoopo, ma le malosi saoloto o le 8.8;e le gata i lea, o se dimer e sili atu ona ogaoga e aliali mai i le 3' fa'ai'uga, ma o se dimer o 4 fa'avae soso'o e aliali mai.E ui lava e le maualuga le malosi saoloto, o le 3′ dimer Chl e mafai ona matua aʻafia ai le faʻapitoa o le amplification ma le faʻamalosia lelei.E le gata i lea, e manaʻomia le siakiina o lauulu lauulu, heterodimers, ma le le fetaui.

Fig3 oligo7 su'esu'ega i'uga
Su'esu'ega lelei o le fa'ateleina:
O le fa'ateleina o le fa'aogaina o le PCR e matua a'afia ai i'uga o le PCR.Fa'apea fo'i i le qRT-PCR, o le fa'ateleina o le fa'aleleia e taua tele mo fa'ai'uga fa'atusatusa.Aveese isi vaila'au, masini ma fa'atonuga i totonu o le tali fa'afefe.O le lelei o faʻamuamua e iai foʻi se aafiaga tele i le faʻaleleia atili o le qRT-PCR.Ina ia mautinoa le sao atoatoa o taunuuga, e manaʻomia uma e le faʻatusatusaga o le fluorescence faʻatusatusa ma le faʻatusatusaina atoatoa o le fluorescence e iloa ai le faʻaleleia lelei o mea muamua.O loʻo faʻaalia o le lelei o le faʻaleleia o le qRT-PCR o loʻo i le va o le 85% ma le 115%.E lua auala:
1. auala masani pi'o:
a.Faafefiloi cDNA
e.Fa'aliga fa'alili
c.qPCR
o.Linear regression equation e fa'atatau ai le fa'ateleina o le lelei
2. LinRegPCR
LinRegPCR ose polokalame mo le su'esu'eina o le taimi moni RT-PCR Data, e ta'ua fo'i quantitative PCR (qPCR) fa'amaumauga e fa'atatau i le SYBR Green po'o le kemisi tutusa.O le polokalame e faʻaogaina faʻamaumauga e le faʻasaʻoina, faʻatino se faʻasaʻoga faʻavae i luga o faʻataʻitaʻiga taʻitasi Vaʻavaʻavaʻavaʻa, fuafua se faʻamalama-o-linearity ona faʻaaogaina lea o le suʻesuʻeina o le laina laina e fetaui ma se laina saʻo e ala i le seti o faʻamaumauga PCR.Mai le malifa o lenei laina o le PCR lelei o faʻataʻitaʻiga taʻitasi e fuafua.Ole fua ole PCR lelei ile amplicon ma le tau ole Ct ile fa'ata'ita'iga e fa'aogaina e fa'atatau ai se fa'amataga fa'amataga ile fa'ata'ita'iga, fa'aalia i iunite fa'alili ole fa'atonu.O fa'amatalaga tu'uina ma fa'aulufale e ala mai i le Excel spreadsheet.Na'o le fa'ata'ita'iga
e mana'omia le fa'afefiloi, leai se fa'alili
laasaga e manaʻomia:(Ave Bole CFX96 o se faʻataʻitaʻiga, e le o se masini e iai le ABI manino)
fa'ata'ita'iga:ose fa'ata'ita'iga masani qPCR.
qPCR fa'amatalaga fa'amatalaga:LinRegPCR e mafai ona iloa ituaiga e lua o faila faila: RDML poʻo le faʻatusatusaina o le faʻaopoopoga o le taunuuga.O le mea moni, o le taimi moni e iloagofie ai le numera o le taamilosaga ma le faailo o le fluorescence e le masini, ma o le faʻalauteleina e maua e ala i le suʻesuʻeina o le suiga o le fluorescence o le laina laina lelei.
Filifiliga fa'amaumauga: I le talitonuga, e tatau ona faʻaaogaina le tau o le RDML.E fa'atatauina o le fa'afitauli o la'u komipiuta e le mafai e le polokalama fa'apipi'i ona iloa le RDML, o lea ua ia te a'u le tau maualuga o le gaosiga e pei o fa'amaumauga muamua.E fautuaina e faia se suʻesuʻega faigata o faʻamatalaga muamua, e pei o le toilalo o le faʻaopoopoina o faʻataʻitaʻiga, ma isi mea e mafai ona tapeina faʻamatalaga i faʻamaumauga o galuega (ioe, e le mafai ona e tapeina, LinRegPCR o le a le amanaʻiaina nei manatu i le taimi mulimuli ane)

Fig5 qPCR fa'amatalaga auina atu i fafo

Fig6 filifiliga o sui tauva

Fa'amatalaga fa'amatalaga:Tatala qualification amplification results.xls, → tatala LinRegPCR → faila → faitau mai le excel → filifili tapulaʻa e pei ona faʻaalia i le Ata 7 → OK → kiliki fuafua laina faʻavae

Ata 7 laasaga o faʻamatalaga faʻamatalaga linRegPCR

I'uga:Afai e leai se toe fai, e leai se fa'avasegaga e mana'omia.Afai e i ai le toe fai, e mafai ona faʻasaʻo le faʻavasegaina i le faʻavasegaina o faʻataʻitaʻiga, ma o le igoa o le gene e tuʻuina i totonu o le faʻamatalaga, ona otometi lava lea ona faʻapipiʻiina le gene tutusa.Mulimuli ane, kiliki i le faila, export excel, ma vaʻai iʻuga.O le a faʻaalia le faʻaleleia lelei ma R2 iʻuga o vaieli taʻitasi.Lona lua, afai e te vaevae i vaega, o le a faʻaalia le faʻasaʻoina o le faʻaleleia o le faʻaleleia.Ia mautinoa o le faʻaleleia lelei o faʻamatalaga taʻitasi o loʻo i le va o le 85% ma le 115%.Afai e tele tele pe laʻititi foi, o lona uiga e le lelei le faʻaleleia atili o le mea muamua.

Ata 8 I'uga ma fa'amaumauga

Fa'agasologa fa'ata'ita'iga:
RNA tulaga manaomia:
mama:1.72.0 o loʻo faʻaalia ai e ono iai le isothiocyanate totoe.O le mama nucleic acid A260 / A230 e tatau ona i ai i le 2. Afai o loʻo i ai se malosi malosi i le 230 nm, o loʻo faʻaalia ai o loʻo i ai mea faʻapitoa e pei o phenate ions.E le gata i lea, e mafai ona iloa e le 1.5% agarose gel electrophoresis.Fa'asino le maka, aua o le ssRNA e leai se denaturation ma le molecular weight logarithm e leai se sootaga laina, ma e le mafai ona fa'aalia sa'o le mamafa mole.Fa'atonuga: Fa'aupugae leaiitiiti ifo i le 100ng / ul, pe afai e maualalo tele le faʻatonuga, o le mama e masani ona maualalo e le maualuga

Ata 9 RNA gel

E le gata i lea, afai e taua le faʻataʻitaʻiga ma maualuga le maualuga o le RNA, e fautuaina e aliquot pe a uma ona aveese, ma faʻafefe le RNA i se faʻasalaga mulimuli o le 100-300ng / ul mo le faʻaliliuina o le faʻaliliuga.I totonule fa'agasologa o fa'aliliuga fa'aliliu, pe a tusia le mRNA, oligo (dt) primers e mafai ona fusifusia faapitoa i polyA siʻusiʻu e faʻaaogaina mo le faʻaliliuina faʻaliliu, aʻo lncRNA ma circRNA faʻaaogaina hexamer faʻafuaseʻi (Random 6 mer) primers mo le faʻaliliuina o le RNA atoa Mo le miRNA, miRNA-specific neck-loop primers o loʻo faʻaaogaina mo le faʻaliliuina faʻaliliu.O le tele o kamupani ua latou fa'alauiloaina ni pusa fa'ailoga fa'apitoa.Mo le auala-loop method, o le siʻusiʻu auala e sili atu ona faigofie, maualuga-throughput, ma reagent-faʻasaoina, ae O le aʻafiaga o le faʻavasegaina o miRNAs o le aiga e tasi e le tatau ona lelei e pei o le auala-loop method.O pusa fa'aliliuga ta'itasi ta'itasi e iai mana'oga mo le fa'atumauina o mata'upu fa'apitoa fa'apitoa (stem-loops).O le faʻamatalaga i totonu o loʻo faʻaaogaina mo le miRNA o le U6.I le fa'agasologa o le fa'aliliuina o le ta'oto'o, e tatau ona toe fesuia'i ese se paipa U6, ma fa'aopoopo sa'o le pito i luma ma tua o le U6.E mafai e le circRNA ma le lncRNA ona faʻaogaina HKG e fai ma faʻamatalaga i totonu.I totonuiloa o le cDNA,
afai e leai se faʻafitauli i le RNA, e tatau foi ona lelei le cDNA.Ae peitaʻi, afai e tuliloaina le atoatoa o le faʻataʻitaʻiga, e sili ona lelei le faʻaogaina o se kenera faʻasino i totonu (Reference gene, RG) e mafai ona iloa le gDNA mai cds.E masani lava, o le RG o se fa'anofo fale., HKG) e pei ona faʻaalia i le Ata 10;I lena taimi, sa ou faia le polotini e teu ai soya, ma faʻaaogaina le actin7 o loʻo i ai introns e fai ma faʻamatalaga i totonu.O le tele o le vaega faʻateleina o lenei mea muamua i le gDNA o le 452bp, ma afai na faʻaaogaina le cDNA e fai ma faʻataʻitaʻiga, o le 142bp.Ona maua ai lea e le suʻega o le Vaega o le cDNA na faʻaleagaina e le gDNA, ma faʻamaonia ai foi e leai se faʻafitauli i le iʻuga o le toe faʻaliliuina, ma e mafai ona faʻaaogaina e fai ma faʻataʻitaʻiga mo le PCR.E leai se aoga e faʻatautaia saʻo ai le electrophoresis gel agarose ma le cDNA, ma o se faʻasalalauga faʻasalalau, e le faʻamaonia.

Ata 10 su'esu'ega cDNA

Le fuafuaina o tulaga qPCRe masani lava e leai se faʻafitauli e tusa ai ma le faʻasologa o le pusa, aemaise lava i le laasaga o le tau tm.Afai e le lelei le fuafuaina o nisi o mea muamua i le taimi o le mamanu muamua, e mafua ai se eseesega tele i le va o le tau tm ma le 60 ° C, e fautuaina le cDNA A maeʻa ona faʻafefiloi faʻataʻitaʻiga, faʻataʻitaʻi se PCR gradient ma primers, ma taumafai e aloese mai le setiina o le vevela e aunoa ma ni fusi e pei o le tau TM.

Iloiloga fa'amaumauga

Ole auala masani ole fa'agasologa ole fua ole PCR ole faiga ole fa'atatau ile 2-ΔΔCT.Fa'ata'ita'iga o fa'amaumauga.

Oloa Fa'atatau:

Faigofie PCR Taimi Moni^TM – Taqman

Faigofie PCR Taimi Moni^TM –SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix mo le strand cDNA synthesis muamua)

RT Easy II(Master Premix mo le vaega muamua o le cDNA synthesis mo qPCR)