O loʻo talanoa tagata uma e uiga i le mataupu faavae o le qRT-PCR faʻataʻitaʻiga, mamanu muamua, faʻamatalaga o taunuuga, ma isi, ae ou te manatu e tatau ona ou faʻasoa atu ia te oe le faʻataʻitaʻiga o le qRT-PCR.E laʻititi, ae faʻatatau i taunuuga.
Aʻo leʻi faia le qRT-PCR, e manaʻomia ona i ai se malamalamaga manino i la tatou lava RNA ma auala faʻagaioiga.A uma mea uma, o a tatou taumafaiga e faʻatatau i le mauaina o taunuuga, nai lo le naʻo le faʻataʻitaʻiga.Aʻo leʻi faia le qRT-PCR, e manaʻomia ona tatou fuafuaina mataupu nei (o nisi o ia mea e naʻo le SYBR).
1 E te mautinoa e le o fa'aleagaina lau RNA?
NanoDrop 2000 e mafai ona naʻo le faʻaogaina ma le mama o le RNA, ae le mafai ona iloa le faʻamaoni o le RNA.
Ole tau ole RNA (RNA Intesity Number) e mafai ona atagia ai le faʻamaoni o le RNA, lea e iloa e le Agilent 2100 Bioanalyzer system.
Ata. Ata fa'ata'ita'i o tau RIN mo fa'ata'ita'iga RNA eseese (eukaryotes)
Ae ui i lea, e masani lava e leai se Agilent 2100 Bioanalyzer i fale suesue.I lenei tulaga, e mafai ona tatou iloa e ala i le formaldehyde gel, ae o le manaʻoga mo le aofaʻi atoa o le RNA e maualuga, o le auala sili ona vave o le faʻaaogaina o le electrophoresis gel masani.E mana'omia le i ai i totonu o se si'osi'omaga e leai ni nuclease, o lea e tatau ai ona fufulu le tane electrophoresis, fagu sol, fa'amau gel ma selu i le vai DEPC.O le agarose fo'i e leai se nuclease (pe'ā fa'ato'a tatalaina), ma o le Loading Buffer e tatau ona tatala fou i le tele e mafai ai, ma le 1.2% gel.
Manatua o le gel e tatau ona faʻamavae atoa, a leai o le a mafua ai fusi faʻatasi, e pei ona faʻaalia i le faʻataʻitaʻiga 9 i le ata.Afai e maualuga tele le voltage po'o le umi tele o le a maua ai le vevela ma mafua ai le fa'aleagaina o le RNA, o lea e tatau ai ona pulea lelei le voltage ma le taimi.E le gata i lea, e mafai foi e le taʻavale gel ona iloa atili pe o iai le DNA o totoe i totonu o le faʻataʻitaʻiga, ma mataʻituina pe o loʻo i ai se numera tele o fusi o loʻo taofia i totonu o le vaieli.
Ata.Gel electrophoresis su'esu'eina o le RNA
2 E te mautinoa i le fa'atonuga o lau cDNA?
O le poto masani o uso tetele i totonu o le falesuesue o le cDNA o le 20 ul system e maua mai i suiga taʻitasi e faʻafefe saʻo 20X, ae o tuafafine postdoctoral e faʻafefeteina 10X.E masani ona ou faalagolago i le tulaga.Talu ai ona o le tulaga lelei o le RNA o loʻo taʻua e tagata taʻitoʻatasi e eseese, o le maualuga o le fesuiaʻiga e ese foi, ma o le tekinolosi faʻaliliu atonu e le mautu.
O lea la, o taimi uma lava ou te maua ai le cDNA fesuiaʻi, o le a ou faʻafefeteina muamua pe a ma le 3 taimi, ona faʻaaoga lea o le faʻamaʻi fale e fai ai le RT-PCR, o le numera o taamilosaga e masani lava 25 taamilosaga, e iloa ai le faʻatonuga faʻapitoa, ona fuafua ai lea o le faʻaiʻuga mulimuli.
3 E te mautinoa e faigofie ona fa'aoga au tusi amata?
E mafai ona pasia le faʻafefeteina o le qRT-PCR, ae o loʻo tau ai pea tupe.Mo fale suʻesuʻe e aunoa ma le tele o tupe, pe a latou maua le tele o faʻamatalaga, e mafai ona latou faʻaogaina le RT-PCR masani e vaʻai ai pe o se faʻaupu e tasi ma faʻamaonia le faʻapitoa o primers.Afai o le falesuesue e le lava se tupe, o le tulaga patino o primers uma e mafai ona iloa tasi e ala i le liusua curve.
4 E te mautinoa e fetaui au tulaga fa'ata'ita'i?
E tatau ona puipuia le SYBR mai le malamalama malosi, o lea taumafai e tape le moli i luga o le ulu pe a faʻaopoopo le SYBR reagent, ma naʻo le manaʻomia o le faʻaogaina o le malamalama mumu e faʻamaeʻa ai.
Teu le SYBR ile 4°C.A fa'aoga, feliuliua'i lemu i luga ma lalo e fa'afefiloi lelei ina ia 'alofia ai le fa'afu, ma 'aua ne'i vili malosi.
O nisi o tuafafine laiti e fiafia e tusi maka i luga o le laupapa PCR ona o le fefefe neʻi faʻafefiloi faʻataʻitaʻiga, e sese.Talu ai o au fa'ailoga e ono a'afia ai le aoina o fa'ailo fa'amalama, e masani lava ona ou fautuaina tamaiti laiti e fa'aoga api fa'ata'ita'i e fesoasoani i le manatua, e pei ona fa'aalia i lalo.
Ata.qRT-PCR fa'ata'ita'iga uta fa'ata'ita'iga
5 E te mautinoa o lo'o e faia sa'o?
Ia mautinoa e fai totigilima, fai totigilima, fai totigilima, ma fai faatolu mea taua.
Ina ia faʻaitiitia le faʻaalia o le SYBR i le malamalama, ou te manaʻo e faʻaopoopo muamua se faʻataʻitaʻiga, e pei ona faʻaalia i le ata o loʻo i lalo.E tusa ai ma le poto masani, o le faʻaopoopoina o se vaega itiiti o faʻataʻitaʻiga e ono mafua ai ni faʻataʻitaʻiga sese.O le mea lea, ina ia faʻaitiitia le mea sese e mafua mai i le faʻaopoopoina o se vaega itiiti o faʻataʻitaʻiga, e masani ona ou toe faaluaina le faʻataʻitaʻiga, ma faʻaluaina le aofaʻi pe a faʻaopoopo le faʻataʻitaʻiga e faʻaitiitia ai le aofaʻi o le H2O2 faaopoopo.
Ata.Ata fa'ata'atia o le utaina o le qRT-PCR
Ona fetuunai lea o le qRT-PCR system e pei ona taua i lalo.
Ata.qRT-PCR ata saunia faiga
FAAMANATU: E manaʻomia le faiga o le faʻatulagaina i luga o le aisa.
A maeʻa ona faʻaopopo le faʻataʻitaʻiga, faapipii le ata faʻamaufaʻailoga manino.Taumafai e aua le paʻi i luga o le ata faʻamaufaʻailoga manino i ou lima, naʻo le faʻaogaina mai le avanoa i itu uma e lua o le ata.Aua e ono a'afia ai fo'i i fa'ailoga tamatamai lima le aoina o fa'ailo fa'amalama.Ona fa'aoga lea o le centrifuge e fa'avave ai le centrifuge mo le 10 s i le saoasaoa maualalo e taofia ai le fa'ata'ita'iga mai le tautau i luga o le puipui.
Oloa Fa'atatau:
Taimi meli: Apr-28-2023
