PCR, tele PCR, I le tulaga PCR, Su'e PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

O le a matou fa'avasega manatu, laasaga ma fa'amatalaga o PCR eseese

Ⅰ. PCR

O le Polymerase Chain Reaction, e taʻua o le PCR, o se molecular biological technology lea e faʻaaogaina e faʻalautele ai vaega DNA patino.E mafai ona manatu o se DNA faʻapitoa faʻapipiʻi in vitro.DNA polymerase (DNA Polymerase I) na maua i le amataga o le 1955, ma Klenow Fragment o E. Coli, lea e i ai le aoga faataitai ma le aoga, na maua e Dr. H. Klenow i le amataga o le 1970, ae ona o lenei enzyme e le taliaina le vevela, o le maualuga o le vevela e mafai ona faʻaleagaina, o lea e le fetaui ma le maualuga o le vevela o le polymerasegene reaction.O enzymes o loʻo faʻaaogaina i aso nei (ua taʻua o le Taq polymerase), na vavae ese mai le Thermus aquaticus, o se vaipuna vevela i le 1976. O lona uiga e mafai ona tetee atu i le maualuga o le vevela ma o se enzyme lelei, ae e faʻaaogaina lautele pe a uma le 1980s.O le uluai manatu o le uluai prototype primitive o le PCR e tutusa ma le toe faaleleia ma le kopiina o kene, lea na faatuina e Dr. KJell Kleppe i le 1971. Na ia lomia le kopi muamua faigofie ma puupuu-manawa (e tutusa ma le lua taamilosaga muamua o le PCR).O le PCR na atiaʻe i aso nei na atiaʻe e Dr. Kary B. Mullis i le 1983. Na tautua Dr. Mullis i kamupani PE i lena tausaga, o lea e iai le tulaga faʻapitoa a le PE i le pisinisi PCR.Na faʻasalalau aloaia e Dr. Mullis le uluaʻi pepa faʻafesoʻotaʻi ma Saiki ma isi i le 1985. Talu mai lena taimi, o le faʻaaogaina o le PCR e faitau afe maila i le aso, ma o le lelei o pepa e fesoʻotaʻi e mafai ona fai mai e faia ai le tele o isi metotia suʻesuʻe e le fiafia.Mulimuli ane, o le PCR tekonolosi e faʻaaogaina lautele i suʻesuʻega faʻasaienisi ma faʻaoga falemaʻi, avea ma tekinolosi sili ona taua o suʻesuʻega o meaola mole mole.Na manumalo foi Mullis i le 1993 Nobel Prize in Chemistry.

PCRMataupu Faavae

O le mataupu faavae o tekinolosi PCR e tutusa ma le faiga masani o le DNA, ma o lona faʻapitoa e faʻalagolago i le oligonucleotide primer e faʻatasi i pito uma e lua o le faʻasologa faʻasologa.O le PCR e aofia ai le faʻaleagaina-faʻamavaeina-faʻalauteleina laasaga faʻavae e tolu: ①Degeneration o DNA mamanu: A maeʻa le faʻamafanafanaina o le DNA template i le tusa ma le 93°C mo se vaitaimi patino, o le vaifofo DNA lua mo le DNA filifili-lua na fausia e le PCR faʻateleina o le DNA mamanu Tuʻua, fai se filifili se tasi ina ia mafai ona tuʻufaʻatasia mo le faʻataʻitaʻiga e sosoo ai e tuʻufaʻatasia mo le faʻasologa e sosoo ai.②O le fa'apipi'iina (fa'afefiloi) o le DNA fa'ata'ita'i ma le mea muamua: A mae'a ona fa'avevela le DNA fa'ata'ita'i ma fa'aleagaina i se filifili e tasi, e pa'ū le vevela ile tusa ma le 55°C.Le fa'asologa fa'atasi o le mea muamua ma le mamanu DNA filifili tasi.③O le faʻaopoopoga o le faʻauluuluga: DNA mamanu-o le faʻamaufaʻailoga muamua e faʻavae i luga o le gaioiga a le TaqDNA polymerase, faʻatasi ai ma le dNTP e fai ma mea mataʻutia.Taofi le mataupu faavae o le toe faia, synthesize se filifili kopi semi-faasao fou e faaatoatoaina le filifili DNA mamanu, ma toe faia le taamilosaga degeneration-annealing-faalautelega tolu faiga e mafai ona maua atili "faʻaagaga kopi filifili", ma o lenei filifili fou e toe maua Avea ma se mamanu mo le isi taamilosaga.E manaʻomia le 2-4min e faʻamaeʻa ai le matasele, e mafai ona faʻalauteleina le kenera faʻapitoa i le tele o miliona taimi i le 2-3 itula.

TulagaPCRReaction System

E lima elemene ole tali ole PCR

E lima ituaiga o mea o lo'o a'afia i le PCR reaction, e pei o le primer, enzyme, dNTP, template ma le buffer (Mg2+ e mana'omia).[Fa'asologa o le PCR]

O le faiga masani PCR ua vaevaeina i ni laasaga se tolu

1. Fa'aleagaina o le DNA (90°C-96°C): Fa'ata'ita'iga DNA e lua-chain i lalo o le fa'avevela, fa'agata fa'amauga o le hydrogen, ma fausia ai se DNA filifili tasi.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): Ua faʻaitiitia le vevela o le tino, faʻapipiʻi le mea muamua ma le DNA template e fausia ai se filifili-lua i le lotoifale.

3. Faʻaopoopoga (70 ℃ -75 ℃): I lalo o le gaioiga a Taq enzyme (e uiga i le 72 ° C, o le gaioiga sili ona lelei), o le dNTP e faʻaaogaina e avea ma mea mataʻutia, faʻalautele mai le 5' pito o le primer → 3' faʻaiʻuga, faʻapipiʻi ma faʻataʻitaʻiga faʻapipiʻi le tasi i le filifili DNA.

Ta'amilosaga ta'amilosaga ta'amilosaga ta'itasi e fa'amuta, fa'apalapala ma fa'alautele, fa'aluaina le anotusi DNA.I le taimi nei, ona o le vaega puupuu o le amplification, o nisi PCR e mafai ona toe faia i se taimi puupuu lava e tusa lava pe le lelei le gaioiga o le enzyme Taq, o lea e mafai ai ona suia i ni laasaga se lua, o lona uiga, o le annealing ma le faʻaopoopoga e mafai ona faia i le 60 ° C-65 ° C i le taimi lava e tasi.Ina ia faʻaitiitia le faʻagasologa o le siitia ma le malulu ma faʻaleleia le saoasaoa o le tali.

Fa'ailoga PCR Reaction

● Faʻamatalaga maualuga

O mea taua fa'apitoa o le tali atu a le PCR o: ①O le tu'ufa'atasiga fa'apitoa o le primer ma le DNA fa'ata'ita'i.②O le mataupu faavae o le faʻapipiʻi faʻavae.③ Le faamaoni o le TaqDNA polymerase synthesis tali.④ Le faʻapitoa ma le faʻasao o le gaʻo taulaʻi.

O le tu'ufa'atasiga sa'o o primers ma templates o le ki.O le fusifusia o le mea muamua ma le faʻataʻitaʻiga ma le faʻalauteleina o le filifili muamua e faʻavae i luga o le faʻavae o le alkaline base matching.O le faamaoni o le polymerase synthesis reactions ma le maualuga o le vevela o le Taq DNA polymerase e faia ai le fusifusia (compound) o le mamanu ma le amataga i le tali e mafai ona faia i se maualuga maualuga.O le faʻapitoa o le tuʻufaʻatasiga ua matua faateleina.O le kilipa e mafai ona faatumauina se maualuga maualuga o le sao.E ala i le filifilia o se itulagi fa'ale-aganu'u e maualuga le fa'asao ma maualuga le fa'asao, o lona fa'apitoa e maualuga atu.

● Maua maualuga

Ole tele ole gaosiga o oloa PCR e faʻateleina ile faʻasinomaga, lea e mafai ona faʻalauteleina le mamanu amata ole Picker (PG=10-12) e faʻateleina ai le maualuga ole microcontroller ile maualuga ole micrograms (μg= -6).E mafai ona iloa se sela taulaʻi mai le 1 miliona sela;i le mauaina o faʻamaʻi, o le maaleale o le PCR e mafai ona oʻo atu i le 3 RFUs (nofoaga gaogao na fausia iunite);ole fua maualalo ole su'esu'ega ile su'esu'ega siama ole 3 siama.

● Faigofie ma vave

O le ata o le PCR e faʻaaogaina ai le maualuga o le vevela o le Taq DNA polymerase, lea e faʻaopoopoina ai le tali tali i le taimi e tasi, o lona uiga, o le faʻaleagaina o le faʻamaʻi-faʻaopoopoga i luga o le DNA amplification solution ma le fagu vai.E masani lava, o le faʻamalosaga faʻamalo e maeʻa ile 2 i le 4 itula.O oloa faʻateleina e masani ona suʻesuʻeina e le pelu eletise, ma e le tatau ona faʻaogaina isotopes, leai se faʻaleagaina o le leitio, ma faigofie faʻalauiloa.

● O le mama o le faʻataʻitaʻiga e maualalo

E leai se mana'oga e tu'u'ese'ese siama po'o siama ma sela fa'aleaganu'u.DNA crude products ma RNA e mafai ona fa'aogaina e fai ma amplifier.Ole su'esu'ega ole DNA e mafai ona fa'aoga sa'o ile fa'aogaina o fa'ata'ita'iga fa'apitoa e pei ole toto, vai ole tino, vai fufulu tale, lauulu, sela, ma aano ola.

PCRfaafitauli masani

● Fa'ase'e leaga, leai ni fusi fa'aopoopo

O vaega taua o le tali atu o le PCR e aofia ai: ① saunia o mamanu nucleic acids, ② lelei ma patino o primers, ③ tulaga lelei o enzymes ④ PCR cycle tulaga.O le mauaina o le mafuaaga e tatau foi ona suʻesuʻeina ma suʻesuʻeina mo soʻotaga o loʻo i luga.

Fa'ata'ita'iga: ① O le fa'ata'ita'iga o lo'o iai polotini 'ese'ese, ② O le fa'ata'ita'iga o lo'o iai le Taq enzyme inhibitor, ③ O le porotini o lo'o i totonu o le fa'ata'ita'iga e le fa'ate'aina, ae maise le vaega porotini i le chromosome.⑤ Deminer nucleic acid degeneration e le atoatoa.A lelei le tulaga lelei o enzymes ma primers, e leai se faʻaopoopoga faʻapipiʻi, lea e foliga mai o le faʻaogaina o meaʻai o faʻataʻitaʻiga.O loʻo i ai se mea sese i le faʻataʻitaʻiga o le faʻaogaina o le acid nucleic acid, o lea e saunia ai se fofo faʻamaʻi lelei ma mautu, e tatau ona faʻamautu lana faʻagasologa ma e le suia faʻafuaseʻi.

Enzyme inactivation: e tatau ona fa'aoga fa'atasi se enzyme fou po'o enzymes tuai ma fou uma e iloilo ai pe leiloa pe le lava le gaioiga o le enzyme, e o'o atu ai i fa'aletonu sese.E tatau ona maitauina o le Taq enzyme poʻo le ethidium bromide e galo i nisi taimi.

Primer: o le tulaga lelei o le faʻamuamua, o le faʻaogaina o le faʻavae, ma pe o le faʻaogaina o mea muamua e lua e tutusa.Ose mafua'aga masani mo le fa'aletonu o le PCR po'o le fa'atuputeleina o fa'a'ili e le lelei ma faigofie ona fa'asalalau.O lo'o i ai fa'afitauli i le tulaga lelei o fa'amuamua o nisi numera o vaega.O mea muamua e lua o loʻo i ai le maualuga maualuga ma le maualalo o le faʻaogaina, mafua ai le maualalo o le asymmetric amplification.O faiga fa'asagatau o le: ① Filifili se fa'amuamua lelei e tu'ufa'atasia iunite.② O le faʻatonuga o le faʻamuamua e le gata e faʻalagolago i le tau o le OD, ae e faʻalogo foi i le vai muamua a le primer e fai ai le agar sugar gel electrophoresis.E tatau ona i ai se sone fa'amaufa'ailoga muamua, ma o le susulu o fa'amatalaga muamua e lua e tatau ona tutusa.Belt, PCR atonu e le manuia i le taimi nei, ma e tatau ona foia i le vaega muamua o le synthesis.Afai e maualuga le mea muamua, e maualalo le susulu, ma e tatau ona faapaleni lona faʻaogaina pe a faʻafefe.③ E tatau ona totogi le mea muamua ma teu i se maualuga maualuga e puipuia ai le tele o le malulu poʻo le umi o vaega pusaaisa o le pusaaisa, lea e mafua ai ona faʻaleagaina ma faʻaleagaina le mea muamua.④ O le mamanu o le mea muamua e le talafeagai, e pei o le umi o le mea muamua e le lava, ma o le di cluster ua fausia i le va o mea muamua.

Mg2+concentration: Mg2+ion concentration ei ai sona aafiaga tele i le PCR amplification lelei.O le fa'atonuga tele e mafai ona fa'aitiitia ai le isi itupa o le fa'alauteleina o le PCR.Afai e maualalo tele le faʻatonuga, o le PCR amplification output o le a oʻo lava ina faʻaletonu le PCR amplification e aunoa ma le faʻalauteleina o le fusi.

Suiga o le voluma tali: O le voluma o loʻo faʻaaogaina i le PCR amplification o le 20ul, 30ul, ma le 50ul poʻo le 100uL, o le tele tele o le talosaga mo le PCR amplification e faʻatulagaina e tusa ai ma faʻamoemoega eseese o suʻesuʻega faasaienisi ma suʻesuʻega falemaʻi.A maeʻa ona faia ni voluma laiti e pei o le 20ul, e manaʻomia le faia o se uaea tulaga pe a faia le tele, a leai o le a le manuia.

Mafuaaga fa'aletino: E taua tele le suiga mo le fa'alauteleina o le PCR.Afai e maualalo le vevela o le degeneration, e puupuu le taimi o le degeneration, e ono tupu i mea leaga sese;maualalo tele le vevela vevela e mafai ona mafua ai le le faʻapitoa faʻapitoa ma faʻaitiitia ai le faʻaogaina o le faʻaleleia.E matua'i a'afia ai le tu'ufa'atasiga o fa'ata'ita'iga ma fa'ata'ita'iga e fa'aitiitia ai le fa'aleleia atili o le PCR.O nisi taimi e manaʻomia le faʻaogaina o thermometers masani e iloa ai le fesuisuiai, faʻafefeteina ma faʻalauteleina le vevela i le faʻaopoopoga poʻo le vai-soluble cooker, o se tasi lea o mafuaʻaga mo le toilalo o le PCR.

Fa'asologa o le fa'asologa: Afai e tupu le fa'asologa o le fa'asologa, o se suiga po'o le tapeina, o le tu'ufa'atasiga o le fa'ata'ita'iga ma le fa'ata'ita'iga e tu'ufa'atasia, pe ona o le leai o se fa'asologa fa'asologa, o le a leiloa le fa'asologa fa'atasi ma le fa'asologa o le PCR, ma o le a le manuia lona fa'alauteleina o le PCR.

● Faʻamatalaga sese

O le PCR amplification band e foliga tutusa ma le faʻasologa o faʻasologa, ma o nisi taimi o lona fusi e sili atu ona lelei ma maualuga.

E le talafeagai le mamanu muamua: o le fa'asologa o le fa'atuputeleina ma le fa'asologa o le fa'alauteleina e le o se fa'amoemoega e tutusa lelei, o lea pe a fa'ateleina le PCR, o oloa fa'apipi'i PCR e leai se fa'amoemoega.O le fa'asologa fa'asologa e pu'upu'u tele pe pu'upu'u fo'i le fa'amuamua, ma e faigofie ona fa'ailoa sese.Manaomia le toe fa'atulagaina.

Fa'aleaga fa'alava ole fa'asologa fa'asologa po'o oloa fa'ateleina: E lua mafua'aga mo lenei fa'aleaga: Muamua, fa'aleaga fa'asala ole genome atoa po'o vaega tetele, e ta'ita'i atu ai i fa'ailoga sese.E mafai ona foia lenei ituaiga o mea sese e ala i auala nei: Fa'aeteete ma agamalu i le taimi o le taotoga e puipuia ai le fa'asologa fa'asologa mai le manavaina i totonu o le fana fa'ata'ita'i po'o le sausau i fafo o le fa'agaau centrifugal.Vagana ai enzymes ma mea e le mafai ona tatalia le maualuga o le vevela, e tatau ona faʻamaʻi faʻamaʻi uma mea faʻapipiʻi poʻo meafaigaluega i le mamafa maualuga.O paipa centrifugal ma faʻataʻitaʻiga e tatau ona faʻaaogaina i le taimi e tasi.Pe a manaʻomia, aʻo leʻi faʻapipiʻi faʻataʻitaʻiga, o le faʻagaioiga tali ma le reagent e faʻaalia i ave o le ultraviolet e faʻaumatia ai le nucleic acid o loʻo iai.Lona lua, o ni vaega laiti i le eleelea o le ea.O nei vaega laiti e pu'upu'u nai lo le fa'asologa fa'asologa, ae o lo'o iai a latou fa'asologa fa'apitoa.E mafai ona sosia le tasi i le isi.A maeʻa ona faʻamaeʻaina mea muamua, e mafai ona faʻalauteleina le oloa PCR, lea o le a mafua ai le gaosiga lelei sese.E mafai ona faʻaaogaina e faʻaitiitia pe faʻaumatia ai le auala PCR ofaga.

● Fa'aalia le fa'aupuga fa'aopoopo e le fa'apitoa

O fusi na aliali mai ina ua maeʻa le PCR faʻateleina e le ogatasi ma le tele o loʻo faʻamoemoeina, poʻo le tele pe laʻititi, poʻo le taimi e tasi, poʻo le taimi e tasi, faʻamaufaʻailoga faʻapitoa ma fusi faʻapipiʻi e le faʻapitoa.O le alia'e mai o pa'u e le fa'apitoa o le: Muamua, e le atoatoa le fa'atasi o fa'auluuluga i le fa'asologa fa'amoemoe, po'o le polymerization o le primer e fausia ai se fuifui di.O le lona lua o le maualuga o le MG2 + ions e maualuga tele, o le vevela faʻafefe e maualalo tele, ma le numera o taamilosaga PCR e fesoʻotaʻi.Lona lua, o le lelei ma le aofaʻi o enzymes.O le tele o taimi, o enzymes o nisi puna'oa e faigofie ona maua i fusi e le fa'apitoa ma e le tupu mai ai enzymes o le isi puna.O nisi taimi e tupu ai foʻi le faʻalauteleina o enzymes e le faʻapitoa.O faiga fa'asagatau o: toe fa'apena fa'alelei pe a mana'omia.Fa'aitiitia le aofa'i ole enzyme pe sui le enzyme ole isi puna.Fa'aitiitia le aofa'i o mea muamua, fa'aopoopo le aofa'i o fa'ata'ita'iga ma le talafeagai, ma fa'aitiitia le aofa'i o ta'amilosaga.Faʻateleina le vevela faʻafefe pe faʻaaoga le auala e lua o le vevela (93°C degeneration, annealing ma faʻalautele ile 65°C).

● Fa'aalia le tosoina o le tosoina po'o le mea fa'apipi'i

O nisi taimi e foliga mai e fa'aoga pe fa'a'afi'i po'o se kapeta-pei o le fusipa'u le fa'aopoopoina o le PCR.Mo le mafuaʻaga, ona o le tele o enzymes poʻo le le lelei o le enzyme, o le dNTP concentration e maualuga tele, o le Mg2 + concentration e maualuga tele, o le vevela o le annealing e maualalo tele, ma le numera o taamilosaga e tele naua.O faiga fa'asaga ia: ①Fa'aiti'i le aofa'i o enzymes, po'o le sui ole enzyme ole isi puna.②Fa'aitiitiga le fa'atonuga o le dNTP ③ Fa'aitiitiga lelei le fa'aogaina o le Mg2+.④ Faʻateleina le aofaʻi o faʻataʻitaʻiga ma faʻaititia le numera o taamilosaga.

Oloa Fa'atatau

PCR Heroᵀᴹ (Fa'atasi ai le Pei)

◮ Faʻamaoni maualuga: 6 taimi nai lo le enzyme masani Taq;

◮ Saosaoa fa'ateleina fa'atele

◮ Tele fa'ata'ita'iga fetuutuunai

◮ Fa'ateleina le fa'asili

◮ E malosi atu le fa'apalepale o le si'osi'omaga: tu'u i le 37°C mo le vaiaso, fa'atumauina le sili atu i le 90% gaioiga;

◮ E iai le 5'→3' DNA polymerase activity ma le 5'→3' exonuclease activity, e aunoa ma le 3'→5' exonuclease activity.

PCR Easyᵀᴹ (Fa'atasi ai le vali)

O le faiga faʻapitoa faʻapitoa ma le maualuga o le Taq DNA Polymerase e faʻaalia ai le tali a le PCR e sili atu le faʻaleleia atili, faʻapitoa ma le maaleale.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Laasaga Tasi)-SYBR Green I

◮ O le pusa e tasi-step e faia ai le fa'aliliuina o tusitusiga ma le qPCR e lua tali i totonu o le paipa lava e tasi, na'o le mana'omia o le fa'aopoopoina o le RNA fa'ata'ita'iga, fa'ailoga PCR fa'apitoa ma le RNase-Free ddH.₂O.

◮ E mafai e le pusa ona su'esu'e vave ma fa'atatau le RNA viral pe su'e le RNA.

◮ O lo'o fa'aogaina e le pusa se mea fa'apitoa e fa'aliliu ai Foregene reverse transcription reagent ma Foregene HotStar Taq DNA Polymerase fa'atasi ma se faiga fa'aalia uiga ese e fa'aleleia atili ai le fa'asili ma le fa'apitoa o le tali.

◮ O le fa'aogaina lelei o faiga fa'afoliga e fa'atupuina ai le fa'atupuina e maualuga atu le ma'ale'ale e iloa ai, malosi fa'amautu vevela, ma sili atu le fa'apalepale.

◮ RT-qPCR Faigofie^TM(One Step) -SYBR Green I kit e sau ma le ROX reference dye, lea e mafai ona faʻaaogaina e faʻaumatia ai faʻailoga faʻailoga ma faʻailoga sese i le va o vaieli, lea e faigofie mo tagata faʻatau e faʻaoga i faʻataʻitaʻiga eseese o meafaifaʻaili PCR quantitative.

RT Faigofie^TMII (Master Premix mo fa'asologa muamua o le cDNA moPCR Taimi Moni)

- Lelei le gafatia e aveese le gDNA, lea e mafai ona aveese le gDNA i le mamanu i totonu ole 2 minute.

- Faiga fa'aliliuga lelei, e na'o le 15 minute e fa'amae'a ai le tu'ufa'atasiga o le strand cDNA muamua.

- Faʻataʻitaʻiga lavelave: faʻataʻitaʻiga e maualuga le GC ma mea faʻapitoa lona lua e mafai foi ona toe fesuiaʻi ma le maualuga maualuga.

-Faiga fa'aliliuga fa'aliliuga maualuga, fa'ata'ita'iga pg-level e mafai fo'i ona maua le cDNA maualuga.

-O le faʻasologa faʻaliliuga faʻaliliuga e maualuga le mautu o le vevela, o le vevela sili ona lelei o le 42 ℃, ma o loʻo i ai pea le lelei o le faʻaliliuina o le faʻasologa i le 50 ℃.