Tekinolosi su'esu'ega mole e fa'aogaina metotia mole biology e iloa ai le fa'aaliga ma le fa'atulagaina o mea fa'atupu o le tino o le tagata ma fa'ama'i eseese, ina ia ausia ai le fa'amoemoega o le vavalo ma fa'ama'i fa'ama'i.

I tausaga talu ai nei, faʻatasi ai ma le faʻaleleia ma le faʻaogaina o tekinolosi faʻataʻitaʻiga mole, o le faʻaogaina o le faʻaogaina o suʻesuʻega mole mole ua sili atu ma sili atu ona loloto ma loloto, ma ua ulufale atu le maketi mole diagnostics i se vaitau o le vave atinaʻe.

O le tusitala o loʻo aoteleina le masani molecular diagnostic technologies i luga o le maketi, ma vaevaeina i ni vaega se tolu: o le vaega muamua o loʻo faʻaalia ai le PCR tekonolosi, o le vaega lona lua o loʻo faʻaalia ai le nucleic acid isothermal amplification technology, ma le vaega lona lua o loʻo faʻaalia ai le tekinolosi faʻasologa.

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Vaega I: PCR Tekinolosi

PCR tekinolosi

O le PCR (polymerase chain reaction) o se tasi lea o tekonolosi fa'alautele DNA in vitro, ma se tala fa'asolopito e silia ma le 30 tausaga.

O tekinolosi PCR na paionia i le 1983 e Kary Mullis o Cetus, ISA.Na talosaga Mullis mo se pateni PCR i le 1985 ma lomia le uluai pepa aʻoaʻoga PCR i le Saienisi i le tausaga lava lea.Na manumalo Mullis i le Nobel Prize in Chemistry i le 1993.

Mataupu Faavae Autu ole PCR

E mafai e le PCR ona faʻalauteleina vaega o le DNA e sili atu ma le tasi miliona taimi.O le mataupu faavae e faapea i lalo o le catalysis o le DNA polymerase, o le matua strand DNA o loʻo faʻaaogaina e fai ma faʻataʻitaʻiga, ma o se mea faʻapitoa e faʻaaogaina e fai ma amataga mo le faʻaopoopoga.E toe faia i vitro e ala i laasaga e pei o le denaturation, annealing, ma le faʻaopoopoga.Le fa'agasologa o le tama'i tama'i pipi DNA e fa'atasi ma le matua fa'ata'ita'iga DNA.

O le faiga masani PCR ua vaevaeina i ni laasaga se tolu:

1. Denaturation: Fa'aaoga le vevela maualuga e tu'u'ese'ese ai fusi fa'alua DNA.O sootaga o le hydrogen i le va o manoa e lua DNA e motusia i le maualuga o le vevela (93-98°C).

2. Fa'amauina: A mae'a ona tu'u'ese'ese le DNA fa'alua, ona fa'aitiitia lea o le vevela ina ia mafai ai e le mea muamua ona fusifusia i le DNA tasi.

3. Fa'aopoopoga: O le DNA polymerase e amata ona fa'apipi'i laina fa'atasi i luga o le DNA mai le fa'amaufa'ailoga o lo'o fusifusia pe a fa'aitiitia le vevela.A maeʻa le faʻaopoopoga, e maeʻa le taamilosaga, ma faʻaluaina le numera o vaega DNA.

O le toe faia o nei laasaga e tolu 25-35 taimi, o le numera o vaega DNA o le a faʻateleina faʻateleina.

O le atamai o le PCR e mafai ona mamanuina faʻamatalaga eseese mo kenera eseese, ina ia mafai ai ona faʻalauteleina vaega o kenera taulaʻi i se taimi puupuu.

I le taimi nei, o le PCR e mafai ona vaevaeina i ni vaega se tolu, e taʻua o PCR masani, PCR faʻateleina ma PCR numera.

Le tupulaga muamua o PCR masani

Fa'aaogā se meafaigāluega fa'alautele PCR masani e fa'alautele ai le kenera fa'atatau, ona fa'aaoga lea o le electrophoresis gel agarose e iloa ai le oloa, na'o le au'ili'iliga lelei e mafai ona fai.

O mea le lelei autu o le PCR muamua o augatupulaga:

- Malamalama i faʻaopoopoga le faʻapitoa ma taunuʻuga lelei sese.

-O le suʻesuʻeina e umi se taimi ma o le gaioiga e faʻalavelave.

-Na'o su'ega fa'apitoa e mafai ona faia.

Augatupulaga lona lua o le fluorescence quantitative PCR

Fluorescence quantitative PCR (Real-Time PCR), lea e taʻua foi o le qPCR, e faʻaaogaina e mataʻituina ai le faʻaputuina o oloa faʻateleina e ala i le faʻaputuina o faailo o le fluorescent e ala i le faʻaopoopoina o suʻesuʻega fluorescent e mafai ona faʻaalia ai le alualu i luma o le faiga tali, ma ia faʻamasinoina taunuuga e ala i le fluorescence curve, ma e mafai ona faʻatusatusa i le fesoasoani o le Cq tau ma tulaga masani.

Talu ai ona o le tekinolosi qPCR o loʻo faʻatinoina i totonu o se faiga tapuni, e faʻaitiitia le avanoa o le faʻaleagaina, ma e mafai ona mataʻituina le faailo o le fluorescence mo le suʻesuʻeina faʻatusatusa, o lea e sili ona faʻaaogaina i le falemaʻi ma ua avea ma tekinolosi sili i le PCR.

E mafai ona vaevaeina mea felanulanua'i o lo'o fa'aaogaina i le PCR fa'a'ale'ale taimi moni i: TaqMan su'esu'ega fa'amalama, moli mole ma lanu felanulanua'i.

1) TaqMan su'esu'e fe'au:

I le taimi o le PCR amplification, e faʻaopoopoina se suʻesuʻega faʻamaʻi faʻapitoa aʻo faʻaopoopoina se pea o primers.O le su'esu'ega o se oligonucleotide, ma o pito e lua o lo'o fa'ailogaina fa'atasi ma se fa'asalalauga fa'asalalau fa'asalalau ma se vaega fa'amalama fa'amae'a.

A fa'amautu le su'esu'ega, o le fa'ailo fa'amalama e tu'uina atu e le vaega fai lipoti e fa'afefe e le vaega fa'amalo;i le taimi o le PCR amplification, o le 5′-3′ exonuclease gaoioiga o Taq enzyme pipii ma degrades le suʻesuʻega, faia le fai lipoti fluorescent vaega ma tineia O le vaega fluorescent ua tuueseeseina, ina ia mafai e le fluorescence mataituina faiga e mafai ona maua le faailo fluorescence, o lona uiga, o taimi uma e matua faateleina ai le DNA strand, o se faiga fluorescent o le fluorescent faakomepiuta o le faʻatupuina o le fluorescent faʻapipiʻiina atoa. le oloa PCR.

2) SYBR lanu felanulanua'i:

I le PCR reaction system, ua fa'aopoopoina le sili atu o le SYBR fluorescent dye.A mae'a ona le tu'ufa'atasia le vali felanulanua'i o le SYBR i totonu o le fa'ailoga fa'alua o le DNA, e fa'ailoa mai ai se fa'ailo fa'alelei.O le mole lanu SYBR e le o tuʻufaʻatasia i totonu o le filifili o le a le tuʻuina atu soʻo se faʻailoga fluorescent, ma faʻamautinoa ai le faʻailoga faʻafefe O le faʻateleina o oloa PCR ua faʻafetaui atoatoa ma le faʻateleina o oloa PCR.SYBR na'o le fusifusia i le DNA fa'alua, o lea e mafai ai ona fa'aoga le liusuavai e iloa ai pe patino le tali a le PCR.

3) moli moli

O se su'esu'ega oligonucleotide fa'ailoga fa'a-fa'a-fa'a-fa'ailoga e fai ai se fausaga fa'aulu e tusa ma le 8 fa'avae i le 5 ma le 3 pito.O fa'asologa o le nucleic acid i pito uma e lua e fetaui lelei, ma mafua ai ona fufusi le vaega felanulanua'i ma le vaega tineia.Tapuni, e le maua ai le fluorescence.

A maeʻa ona gaosia le oloa PCR, i le taimi o le faʻaogaina, o le ogatotonu o le molecular beacon e faʻapipiʻiina ma se DNA faʻapitoa, ma o le gene fluorescent e vavae ese mai le gene quencher e maua ai le fluorescence.

Le faʻaletonu autu o le PCR lona lua:

O lo'o le maua pea le fa'alogona, ma e le sa'o le su'esu'eina o fa'ata'ita'iga e maualalo-kopi.

O lo'o iai fa'aa'afiaga fa'atatau i tua, ma o le i'uga e ono fa'alavelave.

Tulaga lona tolu PCR numera

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) e fa'atatau le numera kopi o le fa'asologa fa'asologa e ala i le su'esu'eina o le fa'ai'uga, ma e mafai ona fa'atino sa'o sa'o le su'esu'ega fa'afuainumera e aunoa ma le fa'aogaina o fa'atonuga i totonu ma pupuni masani.

E fa'aogaina e le PCR fa'atekinolosi le su'esu'ega pito ma e le fa'alagolago i le tau o le Ct (threshold threshold), o lea e fa'aitiitia ai le a'afia o le PCR fa'afuainumera i le fa'atuputeleina lelei, ma fa'aleleia atili le fa'apalepale i le fa'aogaina o le PCR, ma le sa'o maualuga ma le toe fa'aleleia.

Ona o uiga o le maaleale maualuga ma le saʻo maualuga, e le faigofie ona faalavelaveina e PCR tali inhibitors, ma e mafai ona ausia le quantification atoatoa moni e aunoa ma oloa masani, lea ua avea ma se suesuega ma le hotspot talosaga.

E tusa ai ma ituaiga eseese o le vaega tali, e mafai ona vaevaeina i ni ituaiga se tolu: microfluidic, chip ma droplet system.