I faʻataʻitaʻiga qPCR, o le mamanu muamua o se fesoʻotaʻiga taua tele.Pe fetaui lelei pe leai fo'i e feso'ota'i vavalalata pe o'o atu le fa'aleleia lelei i le tulaga fa'ata'atia, pe fa'apitoa mea fa'aopoopo, ma pe maua fa'ai'uga fa'ata'ita'iga.
E fa'afefea la ona fa'alelei atili le fa'amatalaga muamua o le qPCR?maualuga le fa'aolaola lelei?
I aso nei, matou te aveina oe e mamanu faʻatasi qPCR primers, ma tuʻu le qPCR primer design e avea ma tomai faʻapitoa i suʻega.
I le fuafuaina o le qPCR primers, e masani lava ona gauai atu i vaega nei: e tatau ona mamanuina muamua i totonu o le fale i le tele e mafai ai, o le umi o oloa e tatau ona 100-300 bp, o le tau Tm e tatau ona latalata i le 60 ° C, ma le pito i luga ma lalo o le pito i lalo e tatau ona latalata i le mea e mafai ai, ma le pito o le mea muamua e tatau ona G poʻo C, ma isi faʻatali.
1. Fuafuaga o fa'amatamata fa'asolo i totonu
Pe'a fa'ata'atia le qPCR primers, o le filifilia o fa'amaufa'ailoga ua fa'atulagaina i totonu o totonu e mafai ona taofia ai le fa'ata'ita'iga o le gDNA mai le fa'ateleina, ma o oloa e maua uma mai le fa'ateleina o le cDNA, ma fa'aitiitia ai le fa'aleagaina o le gDNA.
2. Ulua'i umi
O le umi muamua e masani lava i le va o le 18-30 nt, ma o le umi o le oloa faʻateleina e tatau ona pulea i le va o le 100-300 bp i le tele e mafai ai.
Afai e pu'upu'u tele le fa'avae, o le a ta'ita'i atu ai i le fa'alauteleina e le fa'apitoa, ma afai e umi tele, o le a faigofie ona fausia le fausaga lona lua (e pei o le fausaga o lauulu).Afai e umi tele le oloa faʻateleina, e le talafeagai mo le tali a le polymerase, lea o le a aʻafia ai le lelei o le PCR amplification.
3. GC anotusi ma Tm tau
Ole mea ole GC ole primers e tatau ona pulea ile va ole 40% ma le 60%.Afai e maualuga tele pe maualalo tele, e le talafeagai le amataina o le gaioiga.Ole mea ole GC ole pito i luma ma tua e tatau ona latalata ile tutusa ina ia maua ai le tau tutusa o le Tm ma le vevela faʻafefe.
O le tau Tm e tatau ona i ai i le va o le 55-65°C i le mamao e mafai ai, e masani lava e tusa ma le 60°C, ma o le Tm tau o le alia i luga ma lalo e tatau ona latalata i le mea e mafai ai, e sili atu i le 4°C.
4. Aloese mai le filifilia o le A i le pito 3′ o le mea muamua
A le fetaui le 3' pito o le mea muamua, o loʻo i ai se eseesega tele i le faʻaogaina lelei o faʻavae eseese.A o le fa'avae mulimuli o le A, e mafai fo'i ona amataina le fa'asologa o filifili e tusa lava pe le fetaui, ma pe a o'o i le fa'avae mulimuli o T A'o a, o le lelei o le fa'aogaina o le mismatch e matua fa'aitiitia.O le mea lea, taumafai e aloese mai le filifilia o le A i le 3' pito o le mea muamua, ma e sili atu le filifilia o le T.
Afai o se su'esu'ega muamua, o le 5' pito o le su'esu'ega e le mafai ona G, aua e tusa lava pe fa'afeso'ota'i se fa'avae G e tasi i le FAM fa'asalalau fa'asalalau vaega, e mafai fo'i e G ona tineia le fa'ailo fa'amalama e fa'aolaina e le vaega FAM, e i'u ai i fa'ai'uga leaga sese.Tulai mai.
5. Tufatufaina faavae
O le tufatufaga o fa'avae e fa i le fa'amuamua e sili ona fa'afuase'i, aloese mai le sili atu i le 3 G po'o le C i le pito 3', ma sili atu i le 3 soso'o.G po'o le C e faigofie ona fa'atupuina fa'atasi i le fa'asologa fa'asologa o le GC.
6. O le vaega muamua o le mamanu e tatau ona aloese mai fausaga lua lavelave.
O le fausaga lona lua e fausia e le manoa tasi o le oloa faʻalauteleina o le a aʻafia ai le alualu i luma malie o le PCR.E ala i le vavalo pe i ai se fausaga lona lua i le faʻasologa faʻasologa muamua, taumafai e aloese mai lenei itulagi i le mamanu o primers.
7. E tatau ona taumafai e 'alo'alo fa'atasi fa'atasi fa'avae fa'atasi.
E le mafai ona i ai so'o se fa'avae fa'atasi fa'atasi i le va o le fa'avae lava ia ma le fa'avae.O le mea muamua lava ia e le tatau ona i ai se faʻasologa faʻatasi, a leai o le a gaugau ia lava e fausia ai se fausaga lauulu, lea o le a aʻafia ai le tuʻufaʻatasiga faʻapipiʻi o le primer ma le mamanu.
E le mafai ona iai ni fa'asologa fa'atasi i le va o fa'auluuluga ma lalo.O le felagolagoma'i i le va o fa'amuamua o le a maua ai dimers muamua, lea o le a fa'aitiitia ai le lelei o le PCR ma o'o lava ina a'afia ai le sa'o sa'o.Afai e le mafai ona alofia le faavae-dimer ma lauulu, o le △G tau e le tatau ona maualuga tele (e tatau ona itiiti ifo i le 4.5 kcal/mol).
8. O primers e fa'amālosia ai le oloa fa'apitoa.
O le sini autu o le su'esu'eina o le qPCR o le malamalama lea i le tele o le kenera taula'i.Afai e tupu le fa'aupuga e le fa'apitoa, o le fa'atusatusaga o le a le sa'o.O le mea lea, a maeʻa ona faʻatulagaina mea muamua, e manaʻomia ona faʻataʻitaʻiina e le BLAST, ma faʻatusatusa le faʻapitoa o oloa i le faʻasologa o faʻamaumauga.
O le isi, matou te ave le tagata GAS6 (Growth arrest specific 6) gene e fai ma faʻataʻitaʻiga i le mamanu qPCR primers.
01 fesili gene
Homo GAS6e ala i le NCBI .O iinei, e tatau ona tatou gauai atu i le faʻatusatusaina o le igoa o le gene ma ituaiga ina ia mautinoa o loʻo tutusa.
02 Su'e le faasologa o kenera
(1) Afai o le faʻasologa faʻasolosolo o le genomic DNA, filifili le mea muamua, o le genomic DNA sequence o le gene.
(2) Afai o le faʻasologa faʻasologa o le mRNA, filifili le mea lona lua.A uma ona ulufale, kiliki "CDS" i le laulau i lalo.O le fa'asologa lanu enaena o le fa'asologa fa'asologa o le gene.
03 Fuafuaga muamua
Ulufale i le Primer-BLAST interface
Ulufale le numera o le gafa poʻo le faʻasologa i le Fasta format i luga o le agavale pito i luga, ma faʻatumu mea talafeagai.

Kiliki le "Get primers" ma o le a oso aʻe le NCBI e taʻu atu ia te oe o le a faʻateleina le filifiliga o le faʻasologa i isi fesuiaiga faʻapipiʻi.E mafai ona matou siakiina le eseesega o le splicing ma tuʻuina atu e maua ai le paʻu muamua talafeagai (e pei ona faʻaalia i le ata o loʻo i lalo).Atonu e sefulu sekone e alu ai lenei faiga.
O le vevela fa'apipi'i o nei taitoalua muamua e tusa ma le 60°C.E tusa ai ma le faʻamoemoega o le faʻataʻitaʻiga, filifili faʻamaufaʻailoga e fetaui lelei le umi, faʻapitoa lelei ma faʻaitiitia le faʻaogaina o mea muamua mo le faʻataʻitaʻiga, ma o le fua faatatau manuia e fai si maualuga!
04Primer fa'amaoniga fa'apitoa
O le mea moni, i le faʻaopoopoga i le faʻatulagaina o mea muamua, e mafai foi e Primer-Blast ona iloilo ia mea muamua na matou mamanuina i matou lava.Toe fo'i i le itulau muamua o le mamanu, ulufale i le pito i luga ma lalo pito i lalo na matou fuafuaina, ma o isi ta'iala o le a le toe fetu'una'i.A maeʻa ona tuʻuina atu, e mafai ona e vaʻai pe o iai foi le paʻu muamua i isi kenera.Afai o loʻo faʻaalia uma i luga o le gaʻo tatou te manaʻo e faʻalautele , e faʻaalia ai o le faʻapitoa o lenei paʻu muamua e sili!(Mo se faʻataʻitaʻiga, naʻo le pau lea o le taunuuga o le suʻega muamua!)

05 Fa'atonuga aupito maualuga
O le a le ituaiga fa'amuamua o le "atoatoa" fa'amuamua e tu'ufa'atasia ai le "fa'ateleina le lelei e o'o i tulaga masani", "fa'ateleina uiga o oloa", ma le "fa'atuatuaina fa'ata'ita'iga taunu'uga"?
Fa'atelega lelei

liu liusuavai
O le faʻaleleia atili o mea muamua e oʻo atu i le 90% -110%, o lona uiga e lelei le faʻaleleia o le faʻaleleia, ma o le faʻafefeteina o loʻo i ai se pito e tasi ma e masani lava Tm> 80 ° C, o lona uiga e lelei le faʻapitoa o le faʻalauteleina.
 
Oloa Fa'atatau:
Taimi Moni PCR Faigofie–SYBR GREEN I
Taimi Moni PCR Easy-Taqman