• O le PCR o se metotia e faʻaaogaina e faʻalautele ai le DNA mai se vaega itiiti o DNA mamanu.E fa'aaoga e le RT-PCR le fa'aliliuga fa'aliliu e maua ai se fa'ata'ita'iga DNA mai se puna RNA e mafai ona fa'ateleina.
• O le PCR ma le RT-PCR e masani lava o tali fa'ai'uga, a'o le qPCR ma le RT-qPCR e fa'aogaina le kinetics o le fua o le fa'asologa o oloa i le taimi o le PCR tali e fa'atatau le aofa'i o fa'ata'ita'iga o lo'o iai.
• O metotia fou, e pei o le PCR numera, e maua ai le aofa'i atoatoa o le ulua'i fa'ata'ita'iga DNA, a'o metotia e pei ole isothermal PCR e fa'aitiitia ai le mana'oga mo masini taugata e maua ai fa'ai'uga fa'atuatuaina.

O le Polymerase chain reaction (PCR) ose faiga fa'aoga faigofie mole mole mole biology e fa'alautele ma iloa ai fa'asologa o DNA ma RNA.Pe a faatusatusa i auala masani o DNA cloning ma amplification, lea e masani ona umi aso, PCR manaomia na o ni nai itula.O le PCR e sili ona maaleale ma e manaʻomia se faʻataʻitaʻiga laʻititi mo le suʻeina ma le faʻalauteleina o faʻasologa faʻapitoa.O metotia fa'avae PCR ua sili atu ona alualu i luma mai le su'esu'eina DNA ma le RNA faigofie.I lalo, ua matou saunia se aotelega o auala eseese PCR ma reagents matou te saunia i Enzo Life Sciences mo au suʻesuʻega manaʻoga.Matou te faʻamoemoe e fesoasoani i saienitisi faʻavave ona maua PCR reagents e faʻaoga i le isi a latou suʻesuʻega poloketi!

PCR

Mo PCR masani, pau lava le mea e te manaʻomia o le DNA polymerase, magnesium, nucleotides, primers, le DNA template e faʻateleina, ma se thermocycler.O le faiga o le PCR e faigofie lava e pei o lona fa'amoemoega: 1) fa'aluaina le DNA (dsDNA) e fa'afefeteina le vevela, 2) fa'amaufa'ailoga e fa'aoga i le DNA e tasi, ma le 3) fa'auluuluga e fa'alautele e le DNA polymerase, ma maua ai ni kopi se lua o le DNA. ulua'i maea DNA.O le denaturation, annealing, ma le elongation faagasologa i luga o se faasologa o vevela ma taimi ua lauiloa o le tasi taamilosaga o le amplification (Ata. 1).

O la'asaga ta'itasi o le ta'amilosaga e tatau ona fa'amanino mo le fa'ata'ita'iga ma le seti muamua na fa'aaogaina.O lenei taamilosaga e toe fai pe a ma le 20-40 taimi, ma o le oloa faʻateleina e mafai ona suʻeina, e masani lava i le gel agarose (Fig. 2).

Talu ai o le PCR o se auala e sili ona maaleale ma e manaʻomia ni voluma laiti mo gaioiga e tasi, o le sauniuniga o se faʻafefiloi sili mo le tele o tali e fautuaina.O le paluga matai e tatau ona faʻafefiloi lelei ona vaelua lea i le numera o tali, faʻamautinoa o le a maua e tali taʻitasi le aofaʻi tutusa o enzyme, dNTPs, ma primers.O le tele o fa'atau oloa, e pei o le Enzo Life Sciences, latou te ofoina atu fo'i fa'afefiloi PCR ua uma ona iai mea uma se'i vaganā ai primers ma le DNA template.

Guanine / Cytosine-oa'oa (GC-mauoa) itulagi fai ma sui o se lu'itau i faiga masani PCR.O fa'asologa mauoa GC e sili atu ona mautu nai lo fa'asologa o lo'o i lalo ifo o le GC.E le gata i lea, o fa'asologa o le GC e masani ona fausia ni fausaga lona lua, e pei o fa'amaufa'ailoga lauulu.O le i'uga, e faigata ona tu'u'ese'ese fa'amuta fa'a'oa GC i le taimi o le denaturation.O le mea lea, e le mafai e le DNA polymerase ona fa'apipi'iina le manoa fou e aunoa ma se fa'alavelave.O le maualuga o le vevela o le denaturation e mafai ona faʻaleleia ai lenei mea, ma fetuunaiga i le maualuga o le vevela faʻafefe ma le puʻupuʻu taimi faʻamaʻi e mafai ona taofia ai le fusifusia le maʻoti o GC-oaʻoa muamua.Reagents faaopoopo e mafai ona faʻaleleia le faʻalauteleina o faʻasologa o le GC.O le DMSO, glycerol, ma le betaine e fesoasoani e faʻalavelaveina fausaga lona lua e mafua mai i fegalegaleaiga GC ma faʻafaigofie ai le tuueseeseina o fusi faʻalua.

PCR amata vevela

Ole fa'aliga fa'apitoa ole fa'afitauli e mafai ona tupu ile taimi ole PCR.Ole tele ole DNA polymerases o lo'o fa'aogaina mo le PCR e sili ona aoga ile vevela ile 68°C i le 72°C.O le enzyme e mafai, peitaʻi, e mafai foi ona galue i le maualalo o le vevela, e ui lava i se tikeri maualalo.I le vevela i lalo ifo o le vevela faʻafefete, e mafai ona fusifusia faʻamaufaʻailoga e le faʻapitoa ma taʻitaʻia ai le faʻalauteleina e le faʻapitoa, tusa lava pe faʻatutuina le tali i luga o le aisa.E mafai ona puipuia lenei mea e ala i le faʻaogaina o le polymerase inhibitors e vavae ese mai le DNA polymerase naʻo le taimi lava e oʻo ai i se vevela, o le mea lea o le upu vevela amata PCR.O le iniseti e mafai ona avea ma antibody e fusifusia ai le polymerase ma denatures i le vevela muamua o le denaturation (95°C masani).

High Fidelity Polymerase

A'o fa'asili sa'o sa'o le DNA polymerases i le fa'asologa fa'ata'ita'iga muamua, e mafai ona tupu ni mea sese ile fa'afetauiga nucleotide.E le fetaui i talosaga e pei o le cloning e mafai ona iu ai i le tipiina o tusitusiga, ma le fa'aliliu sese po'o le le toe gaoioi o polotini i lalo.Ina ia aloese mai nei mea le fetaui, polymerases ma se gaoioiga "faʻamaonia" ua faʻamaonia ma tuʻufaʻatasia i totonu o le galuega.Ole polymerase fa'amaonia muamua, Pfu, na fa'ailoa ile 1991 ile Pyrococcus furiosus.O lenei enzyme Pfu ei ai le 3' i le 5' exonuclease gaioiga.A'o fa'ateleina le DNA, e aveese e le exonuclease ni nucleotides e le fetaui i le pito 3' o le manoa.Ona sui lea o le nucleotide saʻo, ma faʻaauau le faʻasologa o DNA.O le faʻamaoniaina o faʻasologa o le nucleotide le saʻo e faʻavae i luga o le faʻamaufaʻatasiga mo le nucleoside triphosphate saʻo ma le enzyme, lea e le lelei le fusifusia e faʻagesegese ai le faʻapipiʻiina ma mafai ai ona sui saʻo.O le su'esu'eina o le Pfu polymerase e maua ai ni nai mea sese i le fa'asologa mulimuli pe a fa'atusatusa i le Taq DNA polymerase.I tausaga talu ai nei, ua iloa ai isi enzymes e fa'amaonia ai, ma ua faia suiga o le ulua'i enzyme Pfu e fa'aitiitia ai le fa'aletonu i le taimi o le fa'alauteleina o le DNA.

RT-PCR

Reverse transcription PCR, poʻo le RT-PCR, faʻatagaina le faʻaogaina o le RNA e fai ma faʻataʻitaʻiga.O se laasaga faaopoopo e mafai ai ona iloa ma faʻateleina le RNA.O le RNA o loʻo faʻaliliuina i tua i le DNA faʻaopoopo (cDNA), faʻaaogaina le transcriptase faʻaliliu.O le lelei ma le mama o le RNA template e taua mo le manuia o le RT-PCR.O le laasaga muamua o le RT-PCR o le tuʻufaʻatasiga o se DNA / RNA hybrid.Reverse transcriptase e iai foʻi le RNase H galuega, lea e faʻaleagaina ai le vaega RNA o le hybrid.Ona fa'auma lea o le mole mole DNA e tasi e fa'alagolago i le DNA polymerase o le transcriptase i tua i le cDNA.O le lelei o le tali muamua-strand e mafai ona aʻafia ai le faʻagasologa o le faʻalauteleina.Mai iinei i luga, o le masani PCR faiga e faʻaaogaina e faʻalautele ai le cDNA.O le avanoa e toe faʻafoʻi ai le RNA i le cDNA e le RT-PCR e tele naua mea lelei, ma e faʻaaoga muamua mo suʻesuʻega faʻamatalaga o gene.O le RNA e tasi le saisai ma e matua le mautu, lea e faigata ai ona galue.E masani ona avea o se laasaga muamua i le qPCR, lea e fuaina ai RNA transcripts i se faʻataʻitaʻiga olaola.

qPCR ma RT-qPCR

Quantitative PCR (qPCR) e faʻaaogaina e suʻe, faʻavasega ma faʻatatauina nucleic acids mo le tele o talosaga.I le RT-qPCR, RNA transcripts e masani ona faʻatusatusaina e ala i le toe faʻaliliuina i totonu o le cDNA muamua, e pei ona faʻamatalaina i luga, ona fai ai lea o le qPCR.E pei o le PCR masani, o le DNA e faʻateleina i laasaga e tolu toe fai: denaturation, annealing, ma elongation.Ae ui i lea, i le qPCR, faʻailoga faʻafefeteina e mafai ai ona aoina faʻamaumauga aʻo faʻagasolo le PCR.O lenei metotia e tele aoga ona o le tele o metotia ma kemisi o loʻo maua.

I le qPCR e fa'atatau i le vali (e masani ona lanu meamata), e fa'ataga ai le fa'avasegaina o mole mole DNA fa'ateleina e ala i le fa'aogaina o le vali fa'amaua dsDNA.I ta'amilosaga ta'itasi, e fuaina le fluorescence.O le faailo o le fluorescence e faʻateleina faʻatusatusa i le aofaʻi o le DNA toe faia.O le mea lea, o le DNA o loʻo faʻatusatusaina i le "taimi moni" (Fig. 3).O mea le lelei ile qPCR ile vali e na'o le tasi le sini e mafai ona su'eina i le taimi ma o le vali o le a fusifusia i so'o se ds-DNA o lo'o iai i le fa'ata'ita'iga.

I le qPCR e fa'atatau i su'esu'ega, e tele fa'amoemoe e mafai ona iloa i le taimi e tasi i fa'ata'ita'iga ta'itasi, ae e mana'omia le fa'ata'ita'iga ma le fa'atulagaina o se su'esu'ega fa'apitoa e fa'aoga fa'aopoopo i fa'amatamata.E tele ituaiga o su'esu'ega o lo'o avanoa, ae o le ituaiga sili ona taatele o le hydrolysis probe, lea e aofia ai le fluorophore ma le tineia.Ole fa'aliliuina ole malosi ole fa'alili ole feula (FRET) e taofia ai le fa'aosoina ole fulafula e ala ile tineia a'o fa'amauina le su'esu'ega.Ae ui i lea, i le taimi o le PCR tali, o le suʻega e faʻafefeteina i le taimi o le faʻaopoopoga muamua ma le faʻalauteleina o le faʻasologa patino o loʻo noatia i ai.O le vaeluaga o le suʻega e vavae ese ai le fluorophore mai le tineia ma maua ai se faʻaopoopoga faʻalagolago i le fluorescence (Fig. 4).O le mea lea, o le faailo o le fluorescence mai se faʻataʻitaʻiga o le qPCR e faʻatatau i le aofaʻi o le faʻasologa o le suʻega o loʻo iai i le faʻataʻitaʻiga.Talu ai o le qPCR fa'avae su'esu'e e sili atu ona fa'apitoa nai lo le qPCR fa'atatau i le vali, e masani lava o le tekonolosi e fa'aaogaina i su'esu'ega fa'ata'ita'iga e fa'atatau i le qPCR.

Fa'ateleina ole Isothermal

Ole PCR o lo'o ta'ua i luga ole auala e mana'omia ai mea taugata e fa'atau ai le vevela e fa'aoso sa'o i luga ma lalo le vevela o potu mo le denaturation, annealing, ma fa'aopoopoga laasaga.O le tele o metotia ua atiaʻe e le manaʻomia ni masini saʻo ma e mafai ona faia i totonu o se vai taele faigofie poʻo totonu foi o sela e fiafia i ai.O nei metotia e ta'ua fa'atasi o le fa'ateleina o le isothermal ma galue e fa'avae i luga o le fa'ateleina, laina, po'o le cascade amplification.

O le ituaiga sili ona lauiloa o le faʻalauteleina o le isothermal o le faʻaogaina o le isothermal amplification, poʻo le LAMP.O lo'o fa'aogaina e le LAMP le fa'aopoopoga fa'atele i le 65⁰C e fa'alautele ai le DNA po'o le RNA.A fa'atinoina le LAMP, e fa i le ono fa'auluuluga e fa'aopoopo i vaega o le DNA fa'amoemoe e fa'aogaina ma le DNA polymerase e fa'atupu ai le DNA fou.E lua o nei mea muamua e iai fa'asologa fa'afetai e iloa ai fa'asologa i isi fa'avae ma fusifusia ai, e fa'ataga ai le fa'atupuina o se fa'a "loop" i totonu o le DNA fa'ato'a fa'apipi'iina ona fesoasoani lea i le fa'amulu muamua i ta'amilosaga mulimuli o le fa'aopoopoga.LAMP e mafai ona faʻaalia i le tele o metotia, e aofia ai le fluorescence, agarose gel electrophoresis, poʻo le colorimetry.O le faigofie o le vaʻaia ma le iloa o le i ai poʻo le leai o se oloa e ala ile colorimetry ma le leai o se mea taugata e manaʻomia na avea ai le LAMP ma se filifiliga talafeagai mo suʻega SARS-CoV-2 i nofoaga e leʻi maua ai suʻesuʻega falemaʻi, poʻo le teuina ma le felauaiga o faʻataʻitaʻiga. e le mafai, po'o totonu o fale su'esu'e e le'i i ai muamua ni mea e fa'aogaina ai le PCR.