Mea amata: RNA

Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) o se metotia faʻataʻitaʻiga faʻaaogaina i suʻega PCR e faʻaaoga ai le RNA e fai ma mea amata.I lenei metotia, o le RNA atoa poʻo le avefeʻau RNA (mRNA) e muamua faʻasalalau i le DNA faʻaopoopo (cDNA) e ala i le faʻaliliuina transcriptase.Mulimuli ane, na faia se tali qPCR e faʻaaoga ai le cDNA e fai ma faʻataʻitaʻiga.RT-qPCR ua faʻaaogaina i le tele o faʻaogaina o meaola mole mole, e aofia ai suʻesuʻega faʻamatalaga o kenera, faʻamaonia faʻalavelave RNA, faʻamaonia microarray, suʻesuʻeina o pathogen, suʻesuʻega faʻamaʻi, ma suʻesuʻega faʻamaʻi.

Tasi-laasaga ma lua-laasaga metotia mo RT-qPCR

RT-qPCR e mafai ona ausia i se tasi-laasaga poʻo le lua-laasaga metotia.O le tasi laʻasaga RT-qPCR e tuʻufaʻatasia le faʻaliliuga faʻaliliu ma le PCR faʻalauteleina, faʻatagaina le faʻaliliuina o le transcriptase ma le DNA polymerase e faʻamaeʻa ai le tali i totonu o le paipa lava e tasi i lalo o tulaga paʻu tutusa.E tasi le laasaga RT-qPCR e manaʻomia le faʻaogaina o faʻasologa faʻapitoa faʻasologa.I le lua-laasaga RT-qPCR, fa'aliliuina fa'aliliuga ma le PCR fa'alauteleina o lo'o fa'atinoina i ni paipa se lua, e fa'aaoga ai pa'u fa'alelei eseese, tulaga tali, ma ta'iala muamua.

oloa fa'atatau:

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Filifiliga o le RNA atoa ma le mRNA

Pe a mamanuina se suʻega RT-qPCR, e taua le filifili pe faʻaaoga le RNA atoa poʻo le mRNA mama e fai ma faʻataʻitaʻiga mo le faʻaliliuina o tusitusiga.E ui lava e mafai e le mRNA ona tuʻuina atu sina lagona maualuga atu, o le RNA atoa o loʻo faʻaaogaina pea.O le mafuaʻaga o lenei mea o le aofaʻi o le RNA e sili atu le taua o se mea amata nai lo le mRNA.Muamua, o le faagasologa e manaʻomia ai ni nai laʻasaga faʻamamaina, lea e faʻamautinoa ai le toe faʻaleleia atili o le faʻataʻitaʻiga ma sili atu le faʻavasegaina o taunuʻuga e amata ai numera sela.Lona lua, e aloese mai le laasaga faʻatamaoaigaina mRNA, lea e mafai ona aloese mai le avanoa o faʻaiʻuga skewed ona o le toe faʻaleleia o mRNA eseese.I le aotelega, talu ai i le tele o faʻaoga o le faʻatusatusaga o le kenera taulaʻi e sili atu le taua nai lo le faʻaogaina atoatoa o le suʻesuʻega, o le RNA atoa e sili atu ona talafeagai i le tele o tulaga.

Fa'aliliuga tusi muamua

I le auala e lua-laasaga, e tolu auala eseese e mafai ona faʻaogaina e faʻaulu ai le cDNA tali: oligo(dT) primers, random primers, poʻo sequence-specific primers.E masani lava, o le oligo(dT) primers ma random primers e fa'aoga fa'atasi.O nei mea muamua e faʻapipiʻi i le mamanu mRNA strand ma maua ai le transcriptase faʻasolosolo ma se amataga mo le faʻapipiʻiina.

Reverse transcriptase

Reverse transcriptase o se enzyme e faʻaogaina le RNA e faʻapipiʻi ai le DNA.O nisi fa'aliliuga fa'aliliuga o lo'o i ai le gaioiga RNase ma e mafai ona fa'aleagaina RNA strands i RNA-DNA hybrid strands pe a mae'a fa'aliliuga.Afai e leai se RNase enzymatic gaioiga, RNaseH e mafai ona faʻaopoopo mo le maualuga o le qPCR lelei.O enzymes e masani ona fa'aaogaina e aofia ai le Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase ma le avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.Mo le RT-qPCR, e sili ona lelei le filifilia o se transcriptase faʻasolosolo ma le maualuga maualuga o le thermostability, ina ia mafai ai ona faia le cDNA synthesis i le maualuga o le vevela, faʻamautinoa le faʻamaoniaina o le RNAs ma le maualuga lona lua fausaga, aʻo faʻatumauina a latou gaioiga atoa i le taimi atoa o le tali, e maua ai le maualuga o le cDNA.

oloa fa'atatau:

Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase

RNase H gaioiga o le faʻaliliuina transcriptase

E mafai e le RNaseH ona faʻaleagaina RNA strand mai RNA-DNA duplexes, faʻatagaina lelei le tuʻufaʻatasia o DNA faʻalua.Ae peita'i, pe a fa'aogaina le mRNA umi e fai ma fa'ata'ita'iga, e ono fa'aleagaina le RNA i se taimi vave, ma mafua ai ona tipi le cDNA.O le mea lea, e masani ona aoga le faʻaitiitia o le RNaseH i le taimi o le cDNA cloning pe a manaʻomia le faʻapipiʻiina o tusitusiga uumi.I se faʻatusatusaga, faʻaliliuina transcriptases ma RNase H gaoioiga e masani ona aoga mo talosaga qPCR aua latou faʻaleleia le faʻafefeteina o RNA-DNA duplexes i le taamilosaga muamua o le PCR.

Fuafuaga muamua

PCR primers fa'aoga mo le qPCR step i le RT-qPCR e tatau ona fa'ata'atia lelei e fa'alautele ai se feso'ota'iga fa'a-exon-exon, lea e ono mafai ai e se fa'amalama fa'amamafa ona sosolo i se tuaoi moni o le exon-intron.Talu ai e le'o fa'ateleina fa'asologa o le genomic DNA o lo'o iai i totonu, o lenei mamanu e fa'aitiitia ai le lamatiaga o mea sese fa'ateleina mai le fa'aleagaina o le DNA genomic.

Afai e le mafai ona mamanuina fa'avae e tu'uese'ese ai tuaoi o exons po'o exon-exon, atonu e mana'omia le togafitia o fa'ata'ita'iga RNA i le RNase-free DNase I po'o le dsDNase e aveese ai le genomic DNA contamination.

RT-qPCR pulea

O se fa'aliliuga fa'aliliu le lelei fa'atonutonu (-RT control) e tatau ona fa'aaofia i fa'ata'ita'iga uma a le RT-qPCR e iloa ai le fa'aleagaina o le DNA (pei o le genomic DNA po'o le PCR oloa mai tali muamua).O lenei fa'atonuga o lo'o i ai vaega uma e tali atu se'i vagana ai le fa'aliliuina o le transcriptase.Talu ai e le o faia le fa'aliliuga fa'aliliuina i lenei fa'atonuga, afai e matauina le fa'alauteleina o le PCR, o le fa'aleagaina mai le DNA e foliga mai.