I le avea ai ma se mea fou i totonu o le falesuesue, e le o se galuega lelei le suʻeina o laʻau lelei mai le tele o laʻau e maualalo le fua o le liua.Muamua, e tatau ona aveese mai le DNA mai le tele o faʻataʻitaʻiga taʻitasi, ona iloa ai lea o kenera mai fafo e PCR.Ae ui i lea, o taunuuga e masani ona avanoa ma fusi ma ni nai mea i nisi taimi, ae e le mafai ona iloa pe o iai ni faʻamatalaga misi poʻo ni faʻamatalaga sese..Pe e matua leai lava se fesoasoani e feagai ma ia faiga faataitai ma taunuuga?Aua e te popole, o lo'o a'oa'oina oe e le uso i le fa'afaigofie ma le sa'o o le su'eina o la'au lelei transgenic.

Laasaga 1

Fuafuaga su'esu'e muamua

Fuafua le gene endogenous ma exogenous gene e iloa e tusa ai ma le faʻataʻitaʻiga e suʻeina, ma filifili se sui 100-500bp faʻasologa i le gene mo le mamanu muamua.E mafai ona fa'amautinoa le sa'o lelei o fa'ai'uga o fa'amatalaga ma fa'apu'upu'u le taimi e su'e ai (silasila i le fa'aopoopoga mo fa'amatalaga masani e fa'aaogaina).

Fa'aaliga: E mana'omia e fa'ailoga fou fou e fa'amanino tulaga o tali ma fa'amaonia le sa'o, sa'o ma le fa'atapula'aina o le su'esu'ega a'o le'i su'esu'eina tele.

Laasaga 2

Fuafua fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga

Pulea lelei: Fa'aaoga le DNA fa'amama o lo'o iai le vaega fa'atatau e fai ma fa'ata'ita'iga e iloa ai pe o le PCR fa'afoliga faiga ma tulaga e masani ai.

Le lelei/pulea avanoa: Fa'aaoga le DNA template po'o le ddH2O e le o iai le vaega fa'atatau e fai ma fa'ata'ita'iga e iloa ai pe o iai se fa'apogai o le fa'aleagaina ile PCR system.

Fa'atonuga fa'alotoifale: fa'aoga le tu'ufa'atasiga muamua/su'esu'e o le gene o le fa'ata'ita'iga e fa'ata'ita'i e iloilo pe mafai ona iloa e le PCR le mamanu.

Fa'aaliga:

Fa'atonuga lelei, le lelei/ganoa ma fa'atonuga fa'alotoifale e tatau ona fa'atulaga mo su'ega ta'itasi e iloilo ai le sa'o o fa'ai'uga fa'ata'ita'iga.

Sauniuniga faataitai

A'o le'i fa'aogaina, va'ai pe fa'afefiloi tutusa le vaifofo.Afai e maua le timuga, e tatau ona faʻamavae ma faʻafefiloi e tusa ai ma faatonuga aʻo leʻi faʻaaogaina.2×PCR mix e manaʻomia ona paipa ma faʻafefiloi faʻatasi ma se micropipette aʻo leʻi faʻaogaina e aloese ai mai le tufatufaina atu o ion.

Fa'aaliga:

Ave i fafo le tusi lesona ma faitau ma le faaeteete, ma fai sauniuniga a o lei faia le suʻega e tusa ai ma manaoga o le tusi lesona.

Laasaga 4

Saunia PCR faiga tali

E tusa ai ma le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga, faʻafefiloi le primers, H2O, ma le 2 × PCR faʻafefiloi tutusa, centrifuge ma tufatufa atu i faʻagogo tali taʻitasi.

Fa'aaliga:

Mo su'ega tetele po'o umi umi, e fautuaina le fa'aogaina o le PCR reaction system o lo'o iai le enzyme UNG, lea e mafai ona 'alofia lelei le fa'aleagaina o le aerosol e mafua mai i oloa PCR.

Laasaga 5

Fa'aopoopo le fa'ata'ita'iga o tali

Faʻaaogaina tekinolosi PCR Direct, e leai se mea e manaʻomia mo le faʻamamaina o le acid nucleic acid, o le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga e mafai ona saunia i totonu ole 10 minute, ma e mafai ona faʻaopoopoina le PCR tali tutusa.

Fa'aaliga:

O le auala cleavage e sili atu ona lelei le iloa, ma o le oloa na maua e mafai ona faʻaaogaina mo le tele o faʻamatalaga.

5.1: Fa'alautele sa'o o laulaau

E tusa ai ma le tele o le ata o loʻo i totonu o le tusi lesona, tipi le aano o laulaau ma le lautele o le 2-3mm ma tuʻu i le PCR reaction system.

Fa'aaliga: Fa'amautinoa o lo'o fa'ato'ofuina fasi laula'au i le vaifofo tali PCR, ma 'aua ne'i fa'aopoopoina le tele o a'ano lau'au.

5.2: Auala vaelua laulaau

'Otioti le aano lau'au ma le lautele o le 5-7mm ma tu'u i totonu o se fa'agaau fa'anofo.Afai e te filifilia lau la'au matutua, fa'amolemole 'alo'ese mai le fa'aogaina o auga o le vein autu o le lau.Pipette 50ul Buffer P1 lysate i totonu o le centrifuge tube e faʻamautinoa ai e mafai e le lysate ona faʻaofuofu atoatoa le aano o laulaau, tuʻu i totonu o se taʻavale vevela poʻo se taele uʻamea, ma lyse i le 95 ° C mo le 5-10 minute.

Faaopopo le 50ul Buffer P2 neutralization solution ma faʻafefiloi lelei.O le lysate e maua mai e mafai ona faʻaaogaina e fai ma faʻataʻitaʻiga ma faʻaopoopo i le PCR reaction system.

Manatua: O le aofaʻi o faʻataʻitaʻiga i le va o le 5-10% o le PCR system, ma e le tatau ona sili atu i le 20% (mo se faʻataʻitaʻiga, i le 20μl PCR system, faʻaopoopo le 1-2μl o le lysis solution, e le sili atu i le 4μl).

Laasaga 6

tali PCR

A maeʻa ona faʻapipiʻi le PCR reaction tube, e tuʻu i totonu o se mea faigaluega PCR mo le faʻalauteleina.

Fa'aaliga:

O le tali e fa'aaoga ai fa'ata'ita'iga e le fa'amamāina mo le fa'ateleina, o lona uiga o le aofa'i o ta'amilosaga fa'aopoopo e 5-10 sili atu ta'amilosaga nai lo le fa'aaogaina o fa'ata'ita'iga DNA mama.

Laasaga 7

Su'esu'eina ole Electrophoresis ma au'ili'iliga

M: 100bp DNA Apefai

1\4: Fa'amama auala DNA

2\5: auala PCR tuusao

3\6: Pulea avanoa

QC:

O fa'ai'uga o su'ega o ta'iala 'ese'ese o lo'o fa'atulagaina i le fa'ata'ita'iga e tatau ona fetaui ma tu'utu'uga nei.A leai, e tatau ona suʻesuʻeina le mafuaʻaga o le faʻafitauli, ma e tatau ona toe faia le suʻega pe a uma le faʻafitauli.

Fuafuaga 1. Fa'ai'uga masani o su'ega o vaega fa'atonutonu eseese

* Pe a faʻaaogaina le plasmid e fai ma faʻatonuga lelei, e mafai ona le lelei le faʻaiʻuga o suʻega gene

Fa'ai'uga fa'amasinoga:

A. O le suʻega o le suʻega o le gene o le faʻataʻitaʻiga e le lelei, e faʻaalia ai o le DNA talafeagai mo le suʻesuʻeina PCR masani e le mafai ona maua mai le faʻataʻitaʻiga poʻo le DNA na maua mai o loʻo i ai ni faʻalavelave faʻafefe PCR, ma e tatau ona toe aveese le DNA.

B. O le suʻega faʻataʻitaʻiga o le gene endogenous o le faʻataʻitaʻiga e lelei, ma o le suʻega o le gene exogenous e le lelei, e faʻaalia ai o le DNA talafeagai mo le PCR masani e maua mai le faʻataʻitaʻiga, ma e mafai ona faʻamasinoina e le o iloa le gene XXX i le faʻataʻitaʻiga.

C. O le suʻega suʻega o le gene endogenous o le faʻataʻitaʻiga e lelei, ma o le suʻega o le gene exogenous e lelei, e faʻaalia ai o le DNA talafeagai mo suʻesuʻega PCR masani ua maua mai le faʻataʻitaʻiga, ma o le DNA faʻataʻitaʻiga o loʻo i ai le gene XXX.E mafai ona fa'atino atili su'ega fa'amaonia.

Laasaga 8

Fuafuaga su'esu'e muamua

A maeʻa le faʻataʻitaʻiga, faʻaaoga le 2% sodium hypochlorite solution ma le 70% ethanol solution e solo ai le vaega faʻataʻitaʻi e puipuia ai le faʻaleagaina o le siosiomaga.