• facebook
  • linkedin
  • youtube

1. Su'esu'e le mitiia ole RNA solution

Absorbance i le 280, 320, 230, ma le 260 nm o loʻo faʻatusalia ai le taua o le nucleic acid, talaaga (fofo faʻalavelave), masima masima, ma mea faʻaola e pei o le porotini, i le faasologa.E masani lava na'o le va'ai ile OD260/OD280 (Ratio, R).A 1.8 ~ 2.0, matou te manatu o le faʻaleagaina o le polotini poʻo isi mea faʻalaʻau i le RNA e mafai ona faʻafeiloaʻi, ae e tatau ona maitauina pe a faʻaaogaina Tris e pei o le paʻu e iloa ai le faʻaogaina, o le tau o le R atonu e sili atu nai lo le 2 (masani e tatau ona <2.2).A R<1.8, o le filogia o le polotini poʻo isi mea faʻalaʻau i le fofo e sili atu ona manino, ma o le taunuuga o le RNA e mafai ona fuafua e tusa ai ma manaʻoga.A o le R>2.2, o lona uiga o le RNA ua faʻamuta i le tasi nucleic acid.
 
2.Electrophoric mamanu o le RNA
E masani lava, o le denaturing gel e faʻaaogaina mo le RNA electrophoresis, ae afai e naʻo le suʻeina o le lelei o le RNA, e le manaʻomia le denaturing gel, ma e mafai ona faʻaaogaina gel agarose masani.O le fa'amoemoega o le electrophoresis o le su'esu'eina lea o le fa'amaoni o fusi 28S ma le 18S ma o latou fua, po'o le fa'amaoni o le mRNA smear.E masani lava, afai o le 28S ma le 18S fusi e susulu, manino, ma maai (e faasino i pito o fusi e manino), ma o le susulu o le 28S e sili atu nai lo le faaluaina o le 18S band, matou te manatu o le lelei o le RNA e lelei.
O loʻo i luga o auala ia e lua e masani ona matou faʻaaogaina, ae leai se tasi o nei auala e lua e mafai ona taʻu manino mai ia i matou pe o iai le RNase totoe i le RNA solution.Afai o loʻo i ai se vaega itiiti o le RNase i le fofo, e faigata ia i tatou ona iloa i le auala o loʻo i luga, ae o le tele o faʻasologa o le enzymatic mulimuli ane o loʻo faia i luga ole 37 tikeri ma mo se taimi umi.I lenei auala, afai o loʻo i ai se vaega itiiti o le RNase i le RNA solution, ona i ai lea o se siosiomaga talafeagai lelei ma le taimi e faʻatino ai la latou matafaioi i suʻega mulimuli ane, ma o le mea moni o le a malulu le suʻega i lenei taimi.I lalo ifo matou te faʻaalia se metotia e mafai ona faʻamaonia pe o iai le RNase totoe i le RNA solution.
 
3. Su'ega fa'asao vevela
E tusa ai ma le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga, toso lua 1000 ng RNA mai le RNA solution ma faʻaopopo i se 0.5 ml centrifuge tube, ma faʻaopoopo i ai le pH 7.0 Tris paʻu i le aofaʻi atoa o le 10 ul, ona faʻamaufaʻailogaina lea o le pulou o le faʻamau.Tuu se tasi o ia mea i totonu o se vai taele tumau i le 70°C ma fa'a mafanafana mo le 1 itula.O le isi vaega sa teuina i totonu o se pusaaisa -20°C mo le 1 itula.A uma le taimi, aveese faʻataʻitaʻiga e lua mo le electrophoresis.A maeʻa le electrophoresis, faʻatusatusa fusi eletise o le lua.Afai o fusi o le lua e tumau pe leai foi se eseesega tele (o le mea moni, o latou fusi e fetaui ma tulaga i le auala 2), o lona uiga e leai se faʻamaʻi RNase totoe i le RNA solution, ma o le lelei o le RNA e matua lelei lava.I se isi itu, afai o le faʻataʻitaʻiga faʻapipiʻiina i le 70 ° C o loʻo faʻaalia ai le faʻaleagaina, o loʻo faʻaalia ai o loʻo i ai le faʻaleagaina o le RNase i le RNA solution.
 
2 Faʻataʻitaʻiga metotia ma metotia mo le faʻaaogaina o le RNA
O faʻafitauli e masani ona tatou feagai pe a suʻeina le RNA o: (1) RNA fua mai e maualalo;(2) O le RNA e ogaoga le filogia o le masima;(3) O le RNA o lo'o i ai le fa'aleagaina o so'o so'o;(4) faʻataʻitaʻiga faʻaleagaina ma isi faʻafitauli
 
1. E masani ona fa'aogaina le aofa'i o le RNA fa'atosina
O le guanidine isothiocyanate method ma le Trizol method o auala sili ona masani ona faʻaaogaina mo le faʻaaogaina o le RNA atoa mai aano o manu ma sela o manu.E sili ona talafeagai mo tamaʻi faʻataʻitaʻiga ma mea e sili ona faigata ona faʻapipiʻiina, e pei o le aveeseina o le RNA atoa mai le paʻu o le lapiti ma le mea e fesoʻotaʻi ai manu;E le gata i lea, o le Trizol, e pei o se lysis reagent lautele, e mafai foi ona faʻaaogaina mo le faʻaaogaina o aano o laʻau, siama, sigi ma isi mea.Mo laau toto o loʻo i ai polysaccharides ma polyphenols, e pei o le camellia oleifera, lau lauti, rapeseed, ma isi, e mafai foi ona faʻaogaina le auala CTAB e aveese ai le RNA atoa.

I le avea ai o se auala masani, o le auala e lua-koluma e sili ona lauiloa ona o lona faʻaogaina o le vevela masani, e le manaʻomia le faʻaopoopoina o le RNase, ma le saogalemu-leai se chloroform, phenols ma isi mea faʻaola mo le faʻaaogaina.(oloa fautuaina )

1
2

2. Aveese mai le RNA atoa mai aano o manu
 
(1) Taumafai e filifili mea fou, pe afai e le fou (sili i totonu o le tolu masina - 80 ℃ pusaaisa poʻo le aisa i le nitrogen vai. Pe a tipi le meaʻai, aua le tipi saʻo i le vevela o le potu, ia mautinoa e tuʻu i luga o le pusa aisa, taumafai e aloese mai le toe faʻamalo ma faʻafefe.
(2) Faʻaaoga seleulu mama ma tweezers e tipi ai se fasi pepa, taumafai e tipi le ogatotonu o le aano pe a tipi le faʻataʻitaʻiga, poʻo le tipi muamua le fasi pepa tele mai le ogatotonu, ona tipi lea o le faʻataʻitaʻiga i le tulaga fou.O le mea ua aveese e tatau ona faʻamalo atoa, tuʻu le mea faʻapipiʻi i totonu o se EP tube e aunoa ma le RNase, faʻaopoopo le lysate, e tatau ona faʻaalia atoatoa le lysate, ma sauni mo le homogenization.

(3) Mo asi masani, filifili ni mea e lapopo'a ai fatu pi (30-60 mg) mo le fa'atasi.Afai o lo'o i ai i totonu o le a'au se aofaiga tele o polotini, ga'o, po'o aano mafiafia fibrous e pei o le ate, fa'aopoopo pe fa'aitiitia le aofa'i o mea tipi (filifiliga) Filifili le 10~20 mg).
(4) Afai e maua mai maso o i'a, aano o ula, jellyfish ma isi aano o lo'o i ai le tele o vai, e tatau ona fa'atuputeleina le tele o fa'ata'ita'iga (fautuaina 100-200 mg).
(5) Afai e faatagaina tulaga, e mafai ona aveese saʻo le aano o manu pe a uma ona faʻafefiloi ma se faʻaogaina o meaʻai maualuga, pe afai e leai se meafaigaluega faapena.
(6) O le RNA na maua ina ua maeʻa le suʻega mulimuli e tatau ona tuʻuina i luga o le pusa aisa i le taimi lava e faʻaitiitia ai le faʻaleagaina o le RNA.

3. Su'ega RNA sela manu

(1) Suspension cells: centrifuge tuusao ma lafoai le ala, fufulu i le sterile PBS mo 1-2 taimi, ona taofi lea ma se aofaiga talafeagai o le PBS, ona faaopoopo lea o le lysate mo le lysis.Aua ne'i fa'aopoopo sa'o le lysate i sela fa'ato'a pe a uma ona tia'i uma le vai.O lenei mea o le a mafua ai ona faʻamatuʻu le pusa histone pe a maeʻa sela lysed i luga o le pito i fafo e pipii i fafo o sela faʻafefe, ma faʻatapulaaina ai le fesoʻotaʻi o sela i totonu o le pellet ma le lysate., e mafua ai le le atoatoa o le cell lysis ma faʻaititia le RNA fua.

(2) Cells e semi-pipii pe le pipii mau: A uma ona lafoaʻi le ala, fufulu i le PBS mo le 1-2 taimi, ona ave saʻo lea o se aofaiga talafeagai o le PBS ma feula le ipu aganuu i se paipa poʻo se fana e feula ese ai sela, ma faʻafeiloaʻi i sela e leai se RNA.Fa'aopoopo le lysate i le paipa EP o le enzyme mo le aveeseina.

(3) O sela pipii: e manaʻomia ona faʻafefe muamua i le trypsin, ona aoina lea i totonu o le RNase-free EP tubes, centrifuged e aveese ai le supernatant, fufulu 1-2 taimi i le PBS e aveese ai le tele o trypsin, ma toe faʻaleleia i se aofaiga talafeagai o le PBS Ona faʻaauau lea i le laasaga o le aveeseina.

4. La'au RNA fa'atosina

O aano o la'au e mauoa i phenolic compounds, po'o mauoa i polysaccharides, po'o iai ni metabolites lona lua e le'i iloa, po'o le maualuga o le RNase.O mea nei o lo'o tu'ufa'atasia ma le RNA pe a mae'a le lysis cell e fa'atupu ai fa'alavelave fa'alavelave po'o ni pa'u colloidal, e faigata ona aveese.O le mea lea, pe a tatou aveese mai le aano o laau, e tatau ona tatou filifilia se pusa mo laau.O le lysate i totonu o le pusa e mafai ona foia lelei faʻafitauli o le faigofie o le faʻamaʻiina o polyphenols ma le vavaeeseina o polysaccharide compounds ma nucleic acids.

(Mo polysaccharide polyphenol plant RNA extraction, oloa fautuaina:

(1) O le paʻu, pulupulu, fatu, lau, ma isi mea o le laau e tatau ona faʻafefiloi atoatoa i totonu o se sima.I le taimi o le oloina, e tatau ona toe faʻatumu le nitrogen vai i le taimi e aloese ai mai le faʻafefeteina o le faʻataʻitaʻiga.Ole fa'ata'ita'iga ole eleele e tatau ona vave fa'aopoopo ile lysate ma luluina e aloese ai mai le fa'aleagaina ole RNA.

(2) Mo faʻataʻitaʻiga o le fiber-oa e pei o le araisa ma lau saito, e tatau ona faʻaitiitia le aofaʻi o le aveeseina, a leai o le a le maeʻa le oloina o le tino ma le lysis, e mafua ai le maualalo o le fua o le RNA.

(3) Mo aano o la'au e iai le tele o vai, e pei o le rimoni, fua meleni, fua o peach, ma isi, e tatau ona fa'atuputeleina le lapopoa (100-200 mg e filifili).

(4) O aano o laau, e pei o laulaau, rhizomes, fualaau malo ma isi mea e masani ona fautuaina e faʻaaoga le nitrogen vai e faʻafefiloi lelei ai mea o loʻo i totonu o le sima, ona faʻaauau lea i le laasaga o le aveeseina.O mea fa'ameamea masani e le mafai ona aoga i le fa'afefiloi o auga o la'au, ma e masani lava e le fautuaina.

5. Lapataiga mo le RNA fa'amama

(1) E tatau ona fou le fa'ata'ita'iga o mea e mafai ai e 'alofia ai le fa'aisa ma le liu.

(2) O le aano o le aano e tatau ona fa'a'ele'elea atoa i le taimi e aveese ai, ma o le aofa'i o aano e le tatau ona la'ititi, ae le o le tele.

(3) E tatau ona lava le taimi fa'amamago pe a uma ona fa'aopoopo le lysate e fa'amama atoatoa ai le fa'ata'ita'iga.

(4) Pe a faʻaaogaina le auala Trizol mo le faʻaaogaina, o le mataupu faavae o le mitiia o le supernatant pe a uma le stratification o le "sili atu le manava e itiiti ifo nai lo le manava tele", ma e le tatau ona faʻapipiʻiina i le ogatotonu, a leai o le a mafua ai le afaina o le DNA genomic.

(5) Pe a fufulu, e tatau ona ofi atoa le vai fufulu i le puipui o le paipa ina ia mautinoa le fufuluina maeʻaeʻa.

(6) Mo le auala e aveese ai le koluma, e faaopoopo atu i le vavaeeseina o le koluma pe a uma ona fufulu, e tatau foi ona tuu le koluma adsorption i totonu o se nofoa ultra-mama ma feula mo le 5-10 minute e faʻamalo atoa ai le solvent organic i le mago.

(7) I le elution mulimuli o le auala koluma, ina ua uma ona faaopoopo DEPC vai, e tatau ona incubated mo 3-5 minute, po o le vai DEPC e tatau ona vevela i le 60 ° C i luma atu e faateleina ai le elution fua.I le masani Trizol cleavage ma isopropanol precipitation metotia, o le RNA mulimuli e solo i le DEPC vai, o lea e tatau ona tuuina atu se taimi talafeagai mo le faataapeina, ma le pito i lalo o le centrifuge tube e tatau ona faʻaauau pea ona feula i se pito paipa.

3 Ttolu Mafua'aga ma fofo mo le maualalo o le RNA fa'aogaina/le lelei
 
1. E maualalo tele le fua
O le faʻataʻitaʻiga ua maua mai e maualalo tele, o le aofaʻi atoa e le lava, poʻo le faʻataʻitaʻiga ua maua mai e tele naua ma e leʻi maeʻa le lysis;e tatau ona faʻaogaina le tino poʻo sela o le lelei talafeagai mo le aveeseina, o le muaʻi togafitiga o le faʻataʻitaʻiga e tatau ona faia lelei, ma e tatau ona lava le lysis.
 
2. Genome toega
Pe a faʻapipiʻiina e le Trizol auala, pe a suʻeina le supernatant i totonu o le ogatotonu i le maeʻa o le faʻapipiʻiina, o le a mafua ai le afaina tele o genome;e tatau ona fa'aeteete atili pe a fa'apipi'i 'ese'ese mai le susu i totonu o le vaega ogatotonu.Afai e fa'aogaina le auala koluma mo le fa'aaogaina, o se pusa o lo'o i ai le DNase I e mafai ona filifilia mo le fa'aaogaina.O le nucleic acid o loʻo faʻapipiʻiina i luga o le membrane e faʻafefe saʻo i le DNase I, lea e mafai ona faʻaitiitia ai toega DNA.
 
3. Fa'aleagaina RNA
Atonu o le faʻaleagaina o le faʻataʻitaʻiga na maua mai lava ia, poʻo le faʻaleagaina na mafua i le taimi o le faʻaaogaina;i le mamao e mafai ai, e tatau ona faʻaaogaina faʻataʻitaʻiga fou mo le RNA faʻapipiʻiina, ma o faʻataʻitaʻiga ua aoina e tatau ona teuina i totonu o le nitrogen vai poʻo le -80 ° C pusaaisa i le taimi, ma e tatau ona aloese mai le toe faʻamalo ma le faʻafefe.RNase/DNase free fautuaga, centrifuge tubes ma isi mea e tatau ona faʻaaogaina i le faʻagasologa o le RNA.E tatau ona vave le fa'agasologa e mafai ai.O le RNA ua maua e tatau ona tuʻu i luga o se pusa aisa ma teu i le -80 i le taimi.Afai e manaʻomia ona iloa le RNA e maua mai i le gel electrophoresis, e tatau ona faia le electrophoresis i le taimi lava e maeʻa ai, ma e tatau ona suia le paʻu eletise i se mea fou saunia.
 
4. Toega masima ma so'o so'o
O vaila'au fa'atosina e aofia ai masima phenol ma guanidine, ma o le vaifofo fufulu e iai le ethanol.I le taimi o le faʻaaogaina, e leʻi faʻaogaina atoa le lysate ma lafoai, ma e leʻi faʻamago atoa le vaifofo fufulu.O totoe masima ma solvents organic e afaina i le toe fa'aliliuina mulimuli ane ma le PCR.Eseese tikeri o le faʻasaina, o le mea lea e tatau ona aveese atoa le lysate tissue i le faagasologa o le aveeseina, ma le fufuluina e tatau ona lava ina ia mafai ona fufulu puipui o le paipa.E le gata i lea, o le paipa ua gaogao ma feula o se laasaga talafeagai, lea o le a faʻaititia atili ai le toega o mea faʻalaʻau.
 
Mo nisi faʻamatalaga e uiga i le RNA extraction, faʻamolemole mulimuli i la matou upega tafaʻilagi:
www.foreivd.com mo nisi fa'amatalaga.

7

Taimi meli: Tes-01-2022